Эритропоэтин: что это и как он помогает получать достаточно кислорода?

История 1: treg-лимфоциты vs. th17-лимфоциты

Наивные CD4  T клетки в зависимости от микроокружения способны дифференцироваться в различные субпопуляции с весьма отличающимися друг от друга функциями: Th1, Th2, Tfh, Th17 и iTreg. Огромное внимание в вопросах аутоиммунных заболеваний и противоопухолевого иммунитета обращено к двум не так давно открытым популяциям T лимфоцитов — Th17 и iTreg [17].

Th17-клетки дифференцируются из наивных CD4 лимфоцитов под действием TGF-β и IL-6; критичным является активация транскрипционных факторов STAT3 и RORgt. Th17-лимфоциты обладают мощным бактерицидным и фунгицидным действием за счет секреции IL-17 и IL-22.

Индуцированные iTreg дифференцируются из наивных CD4 лимфоцитов под действием TGF-β и IL-2; критичным является активация транскрипционного фактора Foxp3. Treg вырабатывают IL-10, TGFβ, экспрессируют на своей поверхности много интересных молекул (типа рецептора к IL-2 СD25, ингибиторного корецептора CTLA-4), за счет которых проявляют свои иммуносупрессивные свойства.

Итого, мы имеем две субпопуляции лимфоцитов, обладающих диаметрально противоположными свойствами, не способными перепрограммироваться друг в друга и происходящие из единого предшественника — наивных CD4  лимфоцитов. Часто говорят о балансе Treg и Th17, сдвиге баланса либо в иммуносупрессивную, либо в провоспалительную сторону при разных заболеваниях, и подчеркивают первостепенную важность механизмов, определяющих дифференцировку по одному из двух путей. Кратко рассмотрим механизмы и попытаемся понять, в чем соль.

Первое, на что внимательный читатель обратит внимание, это общий для двух субпопуляций индуктор TGFβ. Известно, что сами по себе высокие концентрации TGFβ способны поддерживать активацию Foxp3 и коммитировать образование iTreg. Однако для Th17 также характерна активация Foxp3, которая в обязательном порядке должна быть подавлена.

Теперь о роли HIF-1. Для немиелоидных клеток показано, что активация STAT3 может приводить к негипоксической активации HIF-1. HIF-1, в свою очередь, способен ингибировать Foxp3, причем, вероятно, за счет механизма активации полиубиквитинирования с последующей протеасомной деградацией, т.е. механизма по которому HIF-1 разрушается сам.

Ингибируя Foxp3, HIF-1 способствует дифференцировке CD4 наивных лимфоцитов в Th17 направлении. Что интересно, данную STAT3-зависимую негипоксическую активацию HIF-1 с последующим ингибированием Foxp3 можно заменить циклами периодической гипоксии-нормоксии, которая приводит к стабилизации и накоплению HIF-1 (рис. 8).

Любопытно, что то же самое не случается в условиях длительной гипоксии. И виной здесь отрицательная обратная связь — длительная гипоксия повышает экспрессию HIF-зависимой микроРНК-210, которая способна подавлять трансляцию HIF-1α.

Приведенную выше концепцию особой роли HIF-1 в активации фактора RORgt (критичного для Th17) и ингибирования Foxp3 (критичного для Treg) подтверждает недавняя замечательная статья о роли фактора Deltex1 в поддержании стабильности Foxp3 за счет ингибирования его негативного регулятора HIF-1 [18].

Не так давно была открыта новая субпопуляция лимфоцитов — Tr1, обладающих иммуносупрессивными свойствами, при этом не экспрессирующих Foxp3 (маркер регуляторных T-лимфоцитов). Tr1 играют особую роль в супрессии воспаления в нервной системы и кишечнике [19].

Интересно, что гипоксия и повышенная концентрация внеклеточного АТФ — частые атрибуты воспаления — способны угнетать дифференцировку Tr1-лимфоцитов. Весьма красивым оказался механизм: критичным фактором для дифференцировки в Tr1 лимфоциты является фактор AHR, который при взаимодействии со своим ядерным переносчиком ARNT, переносится в ядро и активирует экспрессию IL-10, IL-21 и прочих факторов, определяющих иммуносупрессивные свойства Tr1-лимфоцитов.

Однако ARNT хорошо известен нам как HIF-1β, кислород независимая субъединица, с которой димеризуется HIF-1α. Между HIF-1α и AHR в указанных условиях происходит конкуренция за ARNT и HIF-1α в этой конкуренции побеждает. Впрочем, если условия позволяют, и в схватке побеждает ARNT, ему есть чем ответить — активируясь, он способствует деградации HIF-1α, предположительно за счет повышения экспрессии пролилгидроксилаз PHDs по кислород-зависимому механизму (рис. 9).

Хочется отметить также, что угнетающая роль HIF-1α на дифференцировку Tr1-лимфоцитов оказалась не столь уж однозначной — исследователи отмечают то, что активность HIF-1α важна на ранних стадиях дифференцировки, главным образом, за счет своей способности переключать метаболизм на гликолитический тип.

Некоторые современные сведения о факторах hif

Далее дорогой читатель будет вынужден простить мне несколько справочный раздел, суммирующий часть современных сведений о факторе HIF.

1. Что есть гипоксия? Нормоксия — условие, при котором концентрация (напряжение) кислорода в окружающей организм/клетку среде «нормальное атмосферное», т.е. близко к 21%. Гипоксия, соответственно, это все, что ниже, гипероксия — все, что выше указанной цифры. На самом деле, понятия эти весьма условны. Классической нормоксии in vivo нет даже для дыхательного эпителия (~14,5%), а большинство тканей в норме прибывает в условиях так называемой физиологической гипоксии (2–9% в зависимости от ткани, обычно около 5%), которая для них и не гипоксия вовсе. Помимо этого, выделяют также умеренную гипоксию, собственно гипоксию и аноксию. Единой чёткой классификации гипоксий нет, но есть попытки (как в таблице 1).
2. Как все начиналось. В самом начале протерозоя — 2,4 млрд. лет назад (или на 830 миллионов лет ранее, если верить совсем свежим данным [3]) — произошла так называемая кислородная катастрофа — довольно стремительное глобальное накопление кислорода в атмосфере Земли, что привело примерно 0,54 млрд. лет назад к формированию атмосферы, близкой к современной. Для многих организмов произошла смена восстановительного, анаэробного типа метаболизма на принципиально новый окислительный тип. Эволюционно возникла потребность в появлении кислород-чувствительного регулятора.
3. Основные принципы работы кислород-чувствительных систем. Кислород-чувствительные системы прокариот и эукариот устроены сходным образом — в роли сенсора выступает фермент 2-оксоглутарат оксигеназа с двухвалентным железом в качестве кофактора [4]. Фермент в условиях нормоксии в присутствии 2-оксоглутара и молекулярного кислорода способен гидроксилировать остатки аминокислот (обычно пролина или аспарагина) в составе белка-регулятора транскрипции или трансляции, регулируя его функции (рис. 2).
   

   Кислород-чувствительная система эукариот (PHD-HIF) претерпевала некоторую эволюцию. Уже довольно сходная с человеческой PHD-HIF система функционирует у Trichoplax adhaerens[5] — примитивного двухслойного животного, еще не обладающего билатеральной симметрией (рис. 3).

4. Факторы HIFs и канонический кислород-зависимый путь регуляции их активности.У эукариот кислород-сенсорная система связана с функционированием важнейшего транскрипционного фактора HIF, регулирующего работу (по разным оценкам) 1–2% всех генов (что довольно приличная цифра). Факторы HIF представляет собой гетеродимерные белки, состоящие из конститутивно экспрессирующейся HIF-β субъединицы и одной из трех кислород-зависимых HIF-α субъединиц (HIF-1α, HIF-2α или HIF-3α), которые формируют при димеризации с β-субъединицами соответственно HIF-1, HIF-2 и HIF-3 (рис. 4). Лучше всего изучены факторы HIF-1 и HIF-2. Роль 2-оксоглутарат оксигеназы у эукариот выполняют пролилгидроксилазы (PHD 1-3), гидроксилирующие в условиях нормоксии остатки пролина в кислород-чувствительной α-субъединице, что приводит к ее деградации. В условиях гипоксии α- и β-субъединицы образуют гетеродимер, перемещаются в ядро и взаимодействуют с особыми последовательностями в промоторах генов HRE (hypoxia responsive elements), активируя экспрессию этих так называемых HIF-зависимых генов.
   В условиях нормоксии транскрипционная активность HIF-1α и HIF-2α регулируется также за счет другого кислород-зависимого фермента — FIH-1 (factor inhibiting HIF-1), который, гидроксилируя остатки аспарагина, способен препятствовать взаимодействию HIFs с кофакторами [6].
5. Неканонические пути регуляции активности факторов HIFs или та самая негипоксическая гипоксия. Помните пример с кобальтовой кардиомиопатией? Это был хороший пример так называемого неканонического пути активации HIF, когда он, по сути, активировался в условиях нормоксии. В данном случае Co² выступает в качестве хелатора Fe² (содержащегося в активном центре пролилгидроксилаз PHD), ингибирует их функцию и нарушает кислород-зависимое разрушение α-субъединицы. Это приводит к активации HIFs в условиях нормоксии. Так у любителей пива происходила постоянная активация HIFs и HIF-зависимого гена эритропоэтина — даже несмотря на то, что в их кровь была пересыщена гемоглобином, и никакой реальной гипоксии, разумеется, не наблюдалось. Воздействовать на Fe²  в составе пролилгидроксилаз PHD способны активные формы кислорода (АФК) [7], которые образуются в клетке в огромном количестве разнообразных процессов.
   Позднее выяснилось, что активность HIF может регулироваться множеством других механизмов на уровне транскрипции, трансляции и посттрансляционных модификаций (фосфорилирование, ацетилирование/деацетилирование, убиквитинирование/деубиквитинирование, SUMO-илирование [8], S-нитрозилирование, NEDD-илирование). Механизмы эти могут быть как зависящими от кислорода, так и нет; как селективными, так и нет по отношению к HIF-1α и HIF-2α изоформам [9]. Но к этому мы вернемся несколько позже.
6. HIF-1 и HIF-2. В чем разница? А теперь еще один важный пункт — изоформоспецифические особенности фактора HIF. Напомню, что существуют главным образом две изоформы — HIF-1 и HIF-2; они обладают примерно 48%-идентичностью по аминокислотной последовательности, имеют один и тот же сайт для посадки — HRE — и, главным образом, один и тот же перечень контролируемых ими генов. Однако есть и особенности.
   • Экспрессия первой изоформы повсеместна; экспрессия же HIF-2 тканеспецифична: это почечная ткань, кишечник, жировая ткань, эндотелий и другие.
   • Существует специфика в активируемых изоформами генов: HIF-1 регулирует экспрессию ключевых ферментов гликолиза: 6-фосфофрукто-2-киназы/фруктозо-2,6-бифосфатазы 3, фосфоглицераткиназы, лактатдегидрогеназы А, карбангидразы-9; некоторых антиапоптотических факторов: BNIP3, BNIP3L; тогда как как HIF-2 (кстати, Семенза открыл именно фактор HIF-2) контролирует экспрессию «фактора стволовости» OCT-3/4 [10, 11], циклина D1, эритропоэтина и другие (рис. 5) [12].
   • В настоящее время формируется парадигма кооперации двух факторов при гипоксии. Очень наглядно эта концепция продемонстрирована на модели динамики роста сосудов в ответ на ишемию и роста опухолевой массы (рис. 6). И в том, и в другом случае первоначально клетки находятся в состоянии выраженной гипоксии (аноксии) и активируются сразу оба фактора — HIF-1 и HIF-2, причем главным «игроком» является HIF-1. В это время происходят критические, быстрые события: стремительное переключение на гликолиз, защита от апоптоза, продукция ростовых факторов. Постепенно происходит переключение на изоформу HIF-2, которая активна при более умеренной гипоксии и более длительное время, экспрессируется другой спектр факторов, определяющих созревание сосудистой сети и дальнейший рост опухоли с метастазированием.
     За переключение изоформ ответственна особая E3 лигаза, названная HAF — hypoxia-associated factor. В условиях продолжительной и незначительной гипоксии она способна связываться с С-концевым доменом HIF-2α, что приводит к его стабилизации и дополнительному повышению трансактивационных свойств HIF-2. В условиях острой, кратковременной гипоксии/аноксии активность ее подавлена.
   • Факторы HIF способны взаимодействовать с другими факторами, как связанными с регуляцией транскрипции (красивый пример — HIF-1 и HIF-2 по-разному взаимодействуют с участниками Notch-сигналинга и по-разному влияют на биологию стволовой клетки глиобластомы [13]), так и не связанными с транскрипцией (взаимодействие с g-секретазой при раке молочной железы [14]). Неканонические взаимодействия HIF-сигналинга, возможно, одна из самых интригующих и многообещающих областей.
7. Случай из практики. В заключение данного раздела скажу, что явления негипоксической активации HIFs и различия в изоформной специфичности между HIF-1 и HIF-2 — это реальные вещи, с которыми я столкнулся лично. В своей дипломной работе я изучал экспрессию эндотелием различных хемокинов под действием ростовых факторов VEGF165 и HGF, по одиночке и в комбинации. Исследовалась закономерная активация киназ ERK-1/2, p38 и активация NF-kB. Экспрессия некоторых хемокинов и факторов адгезии (MCP-1, ICAM-1, VCAM-1) четко ложилась в нашу концепцию о «провоспалительном» действии VEGF165 и «противовоспалительном» действии HGF и согласовывалась с активностью провоспалительного фактора NFkB.
   Однако экспрессия и продукция IL-8 (важнейшего провоспалительного хемокина) регулировалась загадочным и не совсем объяснимым образом. Позднее мы решили эту задачу и нашли, что в нашей системе фактор HGF способен стабилизировать и активировать HIF-2 в нормоксических условиях (скорее всего за счет прямого фосфорилирования HIF-2α и повышения стабильности) и, таким образом, повышать экспрессию и продукцию IL-8 (рис. 7), что и придавало загадочности в профиль его экспрессии [15].

Итак, дорогой читатель, я надеюсь, что вы не сильно утомились ознакомлением первой части рассказа. Скорее перейдем к его иммунологическому разделу!

Приступы удушья — причины появления, при каких заболеваниях возникает, диагностика и способы лечения

Вместо заключения

В настоящее время разработаны/разрабатываются методы селективного ингибирования HIF-1 и HIF-2; селективного ингибирования различных изоформ пролилгидроксилаз PHDs, за счет чего возможно активировать HIF-1 и HIF-2, причем также селективно; можно ингибировать фермент FIH-1и прочие участники пути регуляции кислород-зависимого пути деградации. При желании и достаточной фантазии можно пробовать воздействовать на кислород-независимые пути.

Все это, несомненно, должно найти и, я уверен, найдет применение в практической медицине. Но это потребует крайней обдуманности, многостадийного контроля и досконального изучения. Чем далеко ходить, лучше приведу пример.

Не так давно, в начале-середине 2000-х годов, наблюдался некоторый бум: для многих типов онкологических заболеваний была показана сверхэкспрессия HIF-1α, что вполне соответствовало понятиям об опухолевой биологии: быстрорастущая опухолевая масса в условиях жесткой гипоксии переходит на гликолитический анаэробный тип метаболизма [23], при этом активно секретируя вокруг себя многочисленные факторы роста сосудов, факторы инвазии и т.д. Что делать? Подавим экспрессию HIF-1α и дело в шляпе! Не тут-то было — реальность оказалась сложнее и запутанней.

Так, например, при применении siRNA против HIF-1α на культуре пигментного эпителия сетчатки и эндотелия сосудов, наблюдалось вполне закономерное снижение секреции таких ангиогенных факторов как VEGF, TGF-β (это очень хорошо), но росла секреция IL-8, мощного хемокина с ярко выраженными ангиогенными свойствами (это очень плохо)

[24]. Позднее, группой профессора Лобода был раскрыт механизм — дело в том, что HIF-1 подавляет экспрессию IL-8, а HIF-2 — активирует. Подавляя HIF-1 в клетках, исследователи добивались реципрокной активации HIF-2 и экспрессии IL-8 [25]. Такая неоднозначная выходила терапия.

Также нужно быть аккуратными с иммунной системой. Системное подавление HIF-1 при аутоиммунных заболеваниях, возможно, и приведет к снижению популяции Th17 и росту числа Treg, что теоретически способно облегчить течение заболевания, но также способно привести к искусственному комбинированному иммунодефициту за счет дисфункции M1-макрофагов, нейтрофилов, Th1, Th2, Th17 и СD8  T лимфоцитов.

Это, конечно, спекуляции, но все же.

1. Alexander C.S. (1972). Cobalt-beer cardiomyopathy: a clinical and pathologic study of twenty-eight cases. Am. J. Med. 53 (4), 395–417;
2. Gregg L. Semenza, M.D., Ph.D.Сайт The Johns Hopkins Hospital;
3. Satkoski A.M., Beukes N.J., Li W., Beard B.L., Johnson C.M. (2022). A redox-stratified ocean 3.2 billion years ago. Earth Planet. Sci. Lett. 430, 43–53;
4. Scotti J.S., Leung I.K., Ge W., Bentley M.A., Paps J., Kramer H.B. et al. (2022). Human oxygen sensing may have origins in prokaryotic elongation factor Tu prolyl-hydroxylation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.111 (37), 13331–13336;
5. Loenarz C., Coleman M.L., Boleininger A., Schierwater B., Holland P. W., Ratcliffe P.J., Schofield C.J. (2022). The hypoxia‐inducible transcription factor pathway regulates oxygen sensing in the simplest animal, Trichoplax adhaerens. EMBO Rep. 12 (1), 63–70;
6. Prabhakar N.R. and Semenza G.L. (2022). Oxygen sensing and homeostasis. Physiology. 30 (5), 340–348;
7. Активный кислород: друг или враг, или О пользе и вреде антиоксидантов;
8. SUMO: японская борьба или уникальная посттрансляционная модификация?;
9. Agani F. and Jiang B.H. (2022). Oxygen-independent regulation of HIF-1: novel involvement of PI3K/AKT/mTOR pathway in cancer. Curr. Cancer. Drug Targets. 13 (3), 245–251;
10. Была клетка простая, стала стволовая;
11. Ствол и ветки: стволовые клетки;
12. Koh M.Y. and Powis G. (2022). Passing the baton: the HIF switch. Trends Biochem. Sci. 37 (9), 364–372;
13. Hu Y.Y., Fu L.A., Li S.Z., Chen Y., Li J.C., Han J. et al. (2022). Hif-1α and Hif-2α differentially regulate Notch signaling through competitive interaction with the intracellular domain of Notch receptors in glioma stem cells. Cancer Lett. 349 (1), 67–76;
14. Villa J.C., Chiu D., Brandes A.H., Escorcia F.E., Villa C.H., Maguire W.F. et al. M. (2022). Nontranscriptional role of Hif-1α in activation of γ-secretase and notch signaling in breast cancer. Cell Rep. 8 (4), 1077–1092;
15. Gluhanyuk E., Makarevich P., Gallinger J., Dergilev K., Beloglazova I., Parfyonova Ye. (2022). Diverse modulation of endothelial chemokine production by VEGF165 and HGF via NFkB and HIF-2. Материалы конференции Hypoxia: From Basic Mechanisms to Therapeutics;
16. Palazon A., Goldrath A.W., Nizet V., Johnson R.S. (2022). HIF transcription factors, inflammation, and immunity. Immunity. 41 (4), 518–528;
17. Phan A.T. and Goldrath A.W. (2022). Hypoxia-inducible factors regulate T cell metabolism and function. Mol. Immunol. doi: 10.1016/j.molimm.2022.08.004;
18. Hsiao H.W., Hsu T.S., Liu W.H., Hsieh W.C., Chou T.F., Wu Y.J. et al. (2022). Deltex1 antagonizes HIF-1α and sustains the stability of regulatory T cells in vivo. Nat. Commun. 6, 6353;
19. Yao Y., Vent-Schmidt J., McGeough M.D., Wong M., Hoffman H.M., Steiner T.S., Levings M.K. (2022). Tr1 cells, but not Foxp3 regulatory T cells, suppress NLRP3 inflammasome activation via an IL-10—dependent mechanism. J. Immunol. 195 (2), 488–497;
20. Netea M.G., Latz E., Mills K.H., O’Neill L.A. (2022). Innate immune memory: a paradigm shift in understanding host defense. Nat. Immunol. 16 (7), 675–679;
21. Одураченные макрофаги, или Несколько слов о том, как злокачественные опухоли обманывают иммунитет;
22. Thomas A., Tambuwala M.M., McNicholas W.T., Roche H.M., Taylor C.T., Pepin J.L. et al. (2022). Chronic intermittent hypoxia contributes to pro-inflammatory macrophage alteration in visceral adipose tissue of lean and obese mice. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 191, A2691;
23. Страшней клешней на свете нет…;
24. Forooghian F. and Das B. (2007). Anti-angiogenic effects of ribonucleic acid interference targeting vascular endothelial growth factor and hypoxia-inducible factor-1alpha. Am. J. Ophthalmol. 144 (5), 761–768;
25. Loboda A., Jozkowicz A., Dulak J. (2022). HIF-1 versus HIF-2 — Is one more important than the other?Vascul. Pharmacol. 56 (5), 245–251..