· Первичными АКМ, образующимися в нейтрофилах при кислородном взрыве являются супероксид анион-радикалО2¯ (супероксид) и оксид азота, NO• (нитроксид).
· Образование супероксида происходит при участии HAДФН — оксидазного ферментного комплекса, активируемого фосфолипазами и PK С. При работе данного комплекса НАДФН используется как донор электронов для восстановления молекул кислорода. Очевидно, что образование этого восстановленного кофактора сопряжено с увеличением потребления глюкозы и ее расщепления по механизму гексозомонофосфатного (пентозного) шунта (А).
· Образование супероксид анион-радикала является ключевым моментом, определяющим последующий каскад нарастания других активных форм кислорода. Супероксид обладает бактерицидным действием, но может нанести вред как самим фагоцитам, так и другим клеткам крови. Для нейтрализации супероксид анион-радикалов вырабатываются ферменты — супероксиддисмутазы (СОД). Различаясь по строению активного центра и структуре полипептидной цепи, все СОД катализируют одну и ту же реакцию дисмутации супероксидного радикала (В). При этом супероксид превращается в кислород и перекись водорода – Н2О2.
· Судьба последней может быть разной. В норме фагоциты используют Н2О2 для киллинга микробов, а также для синтеза гипохлорита – ClО¯, взаимодействуя с анионом Cl ¯ (C). Гипохлорит разрушает стенку бактерий, оказывая на них летальное действие. Образование гипохлорита катализируется миелопероксидазой (МП), которая содержится в азурофильных гранулах нейтрофилов и составляет от 2 до 5 % сухого веса клетки. Моноциты содержат лишь 1/3 от МП нейтрофилов, а при дифференцировке в макрофаги вообще ее утрачивают.
· Наряду с этим, перекись водорода может служить базисным материалом в продукции гидроксильного радикала — •ОН и синглетного кислорода — 1О2 (D). Особенность синглетного кислорода состоит в том, что в его молекуле электрон переходит с одной орбитали на другую – параллельную орбиталь, где электрон уже имеется. В результате на одной орбитали образуется пара электронов с противоположным спином (направлением движения), тогда как другая орбиталь остается незаполненной. Такое состояние нестабильно и определяет высокую окислительную активность 1О2.
· Радикал гидроксила •ОН химически наиболее активен и разрушает почти любую встретившуюся ему молекулу. Действуя на SH группу в составе активных центров ферментов, гистидиновые и другие аминокислотные остатки белков, •ОН вызывает динатурацию последних и инактивирует ферменты. В нуклеиновых кислотах •ОН разрушает углеводные мостики между нуклеотидами и, таким образом, разрывает цепи ДНК и РНК, в результате чего происходит мутация и гибель клеток. Таким образом, радикал •ОН — это радикал-разрушитель, радикал-убийца.
· Количество гидроксильного радикала значительно увеличивается в присутствии ионов двухвалентного железа (Е), при участии которого Н2О2 разлагается с образованием гидроксильного анинона (НО¯ ) и гидроксильного радикала (•ОН).
Механизмы образования активных форм кислорода и их утилизация
Гидроксильный радикал образуется и при взаимодействии ионов железа с гипохлоритом (F).
· Таким образом, супероксидный радикал О2¯ и продукты его превращений Н2О2, СlО¯, 1О2, НО• (активированные кислородные метаболиты) при умеренном образовании выполняют ряд полезных функций: оказывают бактерицидное действие, уничтожают отработанные субклеточные структуры, регулируют подвижность мембран, а следовательно, транспорт веществ, ионную проницаемость, рецепторную экспрессию.
· При повышенном образовании активированные кислородные метаболиты представляют опасность для собственных клеток организма. Они способны:
* реагировать с большим набором биологических молекул, включая клеточные и внеклеточные продукты (ДНК, липиды, серосодержащие вещества, медиаторы воспаления, в т.ч. С 5а, хемотаксические пептиды, эйкозаноиды и т.д.), инактивируя их, или стимулировать высвобождение активных медиаторов из тромбоцитов и тучных клеток. Итогом таких взаимодействий является модуляция воспаления и деструкция окружающих тканей, в т.ч. — внеклеточного матрикса;
* реагировать с транзиторными катализаторами (Fe, Cu), что приводит к дальнейшей продукции потенциальных окислителей (см. Е, F);
* осуществлять ковалентное связывание пептидов и молекул ДНК, нарушая их функциональную активность;
* вызывать апоптоз.
Не забудь поделиться страницей с друзьями:
Потребляемый организмом кислород практически полностью (95-98%) расходуется на выработку энергии и окислительный катаболизм субстратов, и лишь малая его часть переходит в активные формы кислорода (уровень АФК в тканях равен примерно 10-8М).
Конфигурация внешней электронной оболочки атома кислорода 2S22P4. Молекула кислорода двухатомна. В основном состоянии (триплетное 3∑-g) два валентных электрона молекулы О2, находящиеся на разрыхляющих орбиталях πх и πу, не спарены (рис. 25) и, таким образом, молекула кислорода является бирадикалом. Помимо основного, существуют еще два долгоживущих возбужденных состояния О2 — синглетное 1Δg (энергия возбуждения 94,1 кДж/моль, время жизни 45 мин) и синглетное 1∑+g (энергия возбуждения 156,8 кДж/моль).
Рисунок 25: Схема распределения электроном по атомным орбиталям молекулы кислорода.
Существует также аллотропная модификация кислорода — азон О3.Озон образует озониды, в которых ионная форма кислорода — О-3. Молекула кислорода образует три различные ионные формы, каждая из которых дает начало классу соединений: О-2 — супероксидам, О22- — пeроксидам, О+2 — диоксигенильным соeдинениям.
Молекула кислорода, присоединяя дополнительный электрон, образует высоко реакцион-носпособный супероксид-радикал (•О2-). Супероксид может порождать вторичные АФК:
— присоединяя еще один электрон, образует короткоживущий пероксид-анион (•О22-), который легко связывает протоны и вследствие этого переходит в Н2О2
— присоединяя NO, образует пероксинитрит (образуется при избытке О2-)
— переводит трехвалентное железо Fe3+ в двухвалентное Fe2+, которое при взаимо-действии с Н2О2, НClО и липоперекисями образует гидроксильный радикал ОН* или липоксильный радикал LO* (образуется при избытке О2-)
— присоединяя 2 протона и электрон, образует перекись кислорода Н2О2 (основной продукт).
Присоединение электрона к Н2О2 ведет к расщеплению молекулы на ионы О2- и О-. В то время как О2- путем присоединения двух протоны образует воду, протонирование О- приводит к особо опасному гидроксил-радикалу (ОН-). Присоединение еще одного электрона и заключительное протонирование ОН- заканчивается образованием воды (рис. 26).
Донорами электронов могут быть Fe2+, Cu+ (из активных центров) или семихиноны, а для второй и третей реакций – также и О2-:
Рисунок 26: АФК.
В клетке активные формы кислорода возникают в результате различных окислитель-восстановительных реакций, протекающих в ней. К АФК относятся супероксид анион-радикал O2.-, перекись водорода H2O2, гидроксильный радикал (ОН-), синглетный O2, озон O3, гипохлорид НClО, окись азота NO и ряд других кислородсодержащих веществ, обладающих высокой окислительной активностью и способных повреждать редокс-чувствительные компоненты клетки, прежде всего белки, липиды и нуклеиновые кислоты.
Раньше полагали, что АФК являются исключительно токсичными для клетки метаболитами и поэтому в клетке существует множество систем для борьбы с ними. Но по мере изучения АФК стало ясно, что они не всегда пагубно влияют на клетку.
Существуют также данные об участии АФК в регуляции редокс-статуса и окислительных модификаций белков.
Регуляция редокс-сигнализации может осуществляться как через общий уровень глутатиона (GSH) в клетке, так и через соотношение GSH/GSSH (рис.29). Глутатион (трипептид Glu-Cys-Gly) находитсяся почти во всех клетках в высокой концентрации и содержит нетипичную γ-связь между Glu и Cys. Восстановителем здесь является тиольная группа цистеинового остатка. Две молекулы восстановленной формы (GSH) при окислении образуют дисульфид (GSSG) (рис. 27). Окислительные модификации затрагивают, как правило, остатки цистеина в функциональных доменах различных белков, приводя к инактивации ферментов, изменению способности связывания транскрипционных факторов с ДНК и другим функциональным нарушениям. При понижении уровня восстановленного глутатиона нарушается проведение сигнала от ряда рецепторов факторов роста и связывание транскрипционных факторов с ДНК, подавляется рост и размножение многих клеточных типов.
Рисунок 27: Глутатион.
Источником АФК в клетке является множество различных ферментативных и неферментативных систем. Одним из главных генераторов АФК в клетке являются пероксисомы, в которых локализован целый ряд образующих перекись водорода ферментов. Эта перекись используется клеткой в основном для детоксикации ксенобиотиков, и практически вся утилизируется внутри этих органелл. В гладком эндоплазматическом ретикулуме локализован ряд цитохром-зависимых оксигеназ, продуцирующих супероксид O2 . –. Очень много образуется АФК в эритроцитах. В плазмалемме макрофагов и эндотелиоцитов существует НАД(Ф)Н-оксидазная система, продуцирующая супероксид анион в ходе иммунного и воспалительного ответа. Остеокласты (специализированные макрофаги) применяют АФК для разрушения кости – обязательное условие ее обновления. При этом клетки-защитники быстро поглощают большое количество O2 (дыхательный взрыв), образуя внешней стороны мембраны супероксид O2 .– за счет окисления цитозольного НАД(Ф)Н.
В клетках образование АФК происходит еще и потому, что в дыхательной цепи митохондрий происходит утечка электронов с комплексов I и III и за счет этого в среднем около 2% поступающего кислорода переходит в активную форму, при этом часть АФК идет на оксидативную модификацию макромолекул. Продукция O2 .– в митохондриях осуществляется несколькими различными путями и значительно зависит от активности дыхания (состояние 3 или 4) и изменений парциального давления кислорода (гипоксия или реоксигенация). Митохондрии более всех других органелл подвержены атаке АФК и, как следствию, повреждению мембранных липидов, углеводов, белков и ДНК, причем для гибели митохондриям не требуется никаких дополнительных белков, кроме тех, которые присутствуют в них самих. Окислительный стресс является причиной множества дегенеративных заболеваний, старения и гибели клетки.
В условиях высокого Δψ в дыхательной цепи усиливается обратный транспорт элект-ронов, и тогда главным продуцентом супероксида становиться комплекс I. При повыше-нии митохондриального трансмембранного потенциала (Δψ) становится дыхательная цепь становиться более восстановленной, что увеличивает образование АФК в Q-цикле.
Как уже было сказано выше, АФК очень реакционноспособные и легко переходят из одной формы в другую (рис. 29), окисляя при этом различные молекулы. Так, в результате утечки электронов из дыхательной цепи и в реакциях НАД(Ф)Н-оксидазы и ксантин-оксидазы первым образуется супероксид анион радикал, который очень быстро дисмутирует до перекиси водорода.
Из всевозможных восстановленных форм кислорода перекись водорода является самым стабильным соединением и обладает меньшей реакционной способностью, нежели другие формы. Молекула H2O2 способна перемещаться в клетке на значительные расстояния и довольно долго сохраняться в ней. Скорее всего, перекись не достаточно активна, чтобы как-то сильно повредить клеточным структурам, а играет роль сигнальной молекулы. При этом в присутствии активаторов, как-то: ионов меди и ионов железа (образуются при окислении железо — серных центров ряда ферментов кислородными радикалами), — из перекиси и супероксида образуется гидроксильный радикал. Гидроксильный радикал является самым опасным и обладает наивысшей реакционной способностью среди всех АФК. Он мог бы разрушить практически все клеточные структуры, но имеет очень маленькое время жизни (около нескольких наносекунд) и не способен диффундировать на значительные расстояния от места образования.
Также супероксид способен реагировать с оксидом азота (II) (обладает сосудо-расширяющим действием) с образованием активного оксиданта пероксинитрита.
При избытке супероксида, он может переводить трехвалентное железо Fe3+ в двухвалентное Fe2+, которое при взаимодействии с Н2О2, НClО и липоперекисями образует гидроксильный радикал ОН* или липоксильный радикал LO*.
Рисунок 29: Переход из одних форм АФК в другие и воздействие на клетку.
Когда митохондрии перестают справляться с проблемой детоксикации образуемых ими АФК, усиливается дисбаланс между их (АФК) генерацией и нейтрализацией, что приводит к так называемому окислительному стрессу. В результате избыточного образования кислородных радикалов, последние начинают выполнять в основном деструктивные функции, нежели служат в качестве сигнальных молекул. Происходят специфические изменения множества клеточных компонентов: повреждаются мембранные структуры из-за перекисного окисления липидов, происходит окисление белков по остаткам тирозина, цистеина и серина, повреждение ДНК, смещение редокс-потенциала клетки из-за окисления глутатиона и НАД(Ф)Н.
Так, примером действие АФК в условиях, способствующих их избыточному образованию, может служить избыток O2, особенно при гипербарической оксигенации (лечение кислородом под повышенным давление), сильного спазма (характерен для инфаркта миокарда или инсульта головного мозга) и реперфузии миокарда после периода ишемии (возобновление кровотока после его нарушения из-за тромбоза, т.е. закупорки сосуда), сопровождающаяся развитием повреждений, сопоставимых по степени с возникшими в результате самой ишемии. Механизм образования АФК при реперфузии, вероятно, обусловлен созданием условий, благоприятствующих образованию вторичных радикалов. Во время ишемии парциальное давление кислорода в кардиомиоцитах резко снижается, и это сопровождается переходом окисленных атомов железа Fe3+ в восстановленные Fe2+, а также повышением активности ксантиноксидазы. Оба эти компонента при появлении в цитоплазме больших количеств кислорода в начале реперфузии резко активируют образование ОН*, и возникающее под действием этого радикала повреждение клеточных структур может приобретать необратимый характер, что вызывает развитие апоптоза
Самым распространенным патологическим состоянием, приводящим к значительной вспышке продукции АФК, является гипоксия и последующая реоксигенация. В ходе продолжительной гипоксии происходит множество изменений в активности ряда клеточных ферментов, истощение и повреждение антиоксидантных защитных систем и быстрое восстановление компонентов дыхательной цепи за счет обращения АТФ-синтазной реакции, используемой для создания протонного градиента в условиях недостатка кислорода. В результате всех этих изменений при последующей реоксигенации утечка электронов с комплексов дыхательной цепи и генерация супероксида значительно увеличивается.
В условиях нормоксии повышенная генерация активных форм кислорода, приводящая к окислительному стрессу, наблюдается обычно только в очагах воспаления. В данном случае кислородный взрыв обусловлен деятельностью НАДФН-оксидазных систем макрофагов и является жестко регулируемым, оказывая деструктивное влияние только на клетки, на которые направлена иммунная реакция.
Поскольку образование АФК в клетках любых аэробных организмов происходит непрерывно, то клетках должны быть и защитная система против их пагубного влияния.
Защита клетки от избытка кислородных радикалов и снижение вызванных ими окислительных повреждений осуществляется двумя принципиально разными механизмами:
1. снижение образования первичных АФК (супероксида) путем уменьшения кислорода в клетке или его более быстрого использования дыхательной цепью ввиду снятия ее контроля ∆μН+
2. функционированием антиоксидантной системы, которая включает антиоксидантные ферменты, низкомолекулярные соединения, образующие редокс-буфер, витамины, альбумины, свободные жирные кислоты и комплексоны ионов металлов (рис. 30).
К нейтрализующим АФК ферментам относятся супероксиддисмутазы (СОД), каталаза и пероксидазы. СОД катализирует дисмутацию двух молекул супероксида с образованием перекиси водорода и O2. Изоформы этого фермента присутствуют во всех клеточных компартментах, где возможно образование супероксида, нейтрализуя O2.-. Образующаяся при дисмутации супероксида перекись нейтрализуется каталазой или глутатион- и тиоредоксин- пероксидазами в пероксисомах.
Внутриклеточный редокс-статус обеспечивается системой тиолов, в первую оче-редь глутатиона (GSH) и тиоредоксина (TRX), которые создают буферную систему для поддержания более восстановленных по сравнению с внеклеточной средой условий.
Глутатион (GSH) и тиоредоксин (TRX) являются важнейшими антиоксидантами в клетке. Глутатион участвует в поддержании редокс-статуса за счет нейтрализации перекиси глутатион-пероксидазой.
Образовавшейся НАДФН+Н+ поставляет Н+ для регенерации восстановленного глутатиона (GSH) из глутатион-дисульфида (GSSG) с помощью глутатион-редуктазы.
Когда митохондрии перестают справляться с проблемой детоксикации АФК, происходит разрушение митохондриальных структур от мембраны до мтДНК. Из АФК только ОН- вызывает повреждения ДНК (окисление оснований, их модификации, повреждение хромосом). Подобные мутации могут привести к патологии и гибели клеток или их злокачественному перерождению (раки, лейкозы).
АФК может повреждать мембраны митохондрий. Так, на первый взгляд не очень опасная молекула пероксида водорода может генерировать гидроксил-радикал в присутствии двухвалентного железа или превращаться в гипохлорит-анион ОСl–ферментом миелопероксидазой. Как гипохлорит-анион, так и гидроксил-радикал являются сильными окислителями. Они способны модифицировать белки, нуклеиновые кислоты, индуцировать перекисное окисление липидов (от которого наиболее сильно «страдают» полиненасыщенные жирными кислотами, входящими в состав мембранных липидов). Так, при перекисном окисление липидов кислородный радикал, чаще всего это бывает гидроксил-радикал, который хорошо проникает в мембраны, будучи незаряженным, отнимает атом водорода от молекулы жирной кислоты с образованием перекисного радикала жирной кислоты. Этот радикал запускает цепную реакцию, взаимодействуя с другой жирной кислотой, в ходе которой образуются перекись кислоты и новый радикал:
Таким образом, затрагивается значительное количество клеточных липидов, и повреждаются мембраны. Кроме того, может происходить и амплификация окислительного повреждения за счет распада гидроперекисей на два новых радикала, каждый из которых запускает свою цепь.
Процессы, протекающие до момента образования гипохлорит-аниона или гидроксил-радикала, локализованы в цитоплазме и контролируются цитоплазматическими ферментами или природными водорастворимыми антиоксидантами. Например, таурин способен связывать гипохлорит-анион в форме хлораминового комплекса, дипептид карнозин и его производные нейтрализуют гидроксил-радикал, а такие соединения, как белое ферритин, связывают железо. Большое значение для предотвращения перекисного окисления липидов, инициируемое в гидрофобном пространстве клеточных мембран, и уничтожения радикалов жирных кислот имеет гидрофобный локализованный в мембранах α-токоферол (витамин Е). Его высокая концентрация в биологических мембранах препятствует их повреждению свободными радикалами. Витамин Е обрывает цепные реакции образования липидных пероксилов, превращаясь в радикал, который регенерирует как с помощью активных водорастворимых восстановителей типа аскорбата и глутатиона, так и с помощью гидрофобного убихинола (см. ниже).
АФК бывают трех типов (Ю.А. Владимиров):
— Первичные (индуцирующие) — образуются при окислении некоторых молекул; к ним относятся оксид азота NO и супероксид О2 -; обладают регуляторным или умеренным антимикробным действием.
— Вторичные — образуются вследствие атаки супероксида других молекул;к ним относятся гидроксильный радикал ОН*, липоксильный радикал LO* и пероксинитрит; обладают сильным токсическим действием вследствие своей способности необратимо повреждать мембранные липиды, а также молекулы ДНК, углеводов и белков
— Третичные — образуются вследствие соединения вторичных радикалов с молекулами антиоксидантов и других легко окисляющихся соединений; их роль может быть различной
При повреждении комплекса I дыхательной цепи происходит прямое окисление белков, разрушение железосерных кластеров, нитрозилирование и глутатионилирование, вследствие чего сильно снижается его активность, что происходит, например, при ишемической болезни сердца (и, как следствия, реперфузии).
При повреждении белков наиболее уязвимыми являются следующие аминокислоты: цистеин, метионин, тирозин, триптофан, фенилаланин, валин, лейцин, гистидин, глутамил, пролин, треонон, аргинин, лизин (табл. 3).
Таблица 3: Модификации аминокислот.
АФК разрушают белки, разделяя их на меньшии пептиды (рис.30). Это происходит следующим образом.
Гидроксил радикал отнимает притон от -CH(R)- группы белка, образую воду (реакции a и b). Образовавшийся алкил радикал может либо связаться со вторым алкил радикалом (реакция р), либо прореагировать с кислородом, образовав алкил пероксид радикал (реакция с). Далее алкил пероксид радикал, присоединяя протон, образует алкил пероксид. Протон он получает реагируя либо с Fe2+ (реакция g), либо с пероксильным радикалом (НО2*) (реакция f). Алкил пероксид белка может реагировать с таким же пероксидом (дисмутация), высвобождая кислоров и образуя алкокси белок (реакция о). Алкокси белок может также образовываться путем восстановления алкил пероксида либо Fe2+ (реакция g), либо пероксильным радикалом (НО2*) (реакция f).
Рисунок 30: Окисление белков по α-амидному и диамидному путям.
Дальнейшее преобразование алкокси белока может пойти двумя альтернативными путями:
— α-амидный путь: алкокси белок может преобразовываться в гиброксильную производную (реакция i, j), пептидня связь которой подвергается в дальнейшем расщеплению (реакция k, l),
— диамидный путь (реакция m).
В итоге исходный белок разделяется на более мелкие пептиды, что приводит к его дисфункции.
Еще одно уязвимое место дыхательной цепи — Q-цикл. В двух Q-связывающих сайтах комплекса III происходит генерация убисемихинон анион радикала. Убисемихинон, образовавшийся в Qp сайте, способен реагировать с молекулярным кислородом с образованием убихинона и супероксида:
В сайте QN активное взаимодействие радикала с кислородом не наблюдается из-за хорошей стабилизации радикала и его глубокого относительно толщи мембраны расположения, так, что кислороду трудновато до него добраться.
При связывании антимицина А с сайтом QN окисление убисемихинона в сайте Qp предотвращается, увеличивается его время существования, что повышает вероятность формирования O2 .–. Супероксид инициирует цепной процесс автоокисления коэнзима, легко окисляя его с образованием новых молекул убисемихинона. Таким образом, одним из главных источников активных форм кислорода в митохондриях является Q-цикл.
В любом случае, образующиеся формы CoQ способны включаться в Q-цикл, и тем самым антиоксидант убихинол постоянно регенерируется.
Кроме явного проявления антиоксидантных свойств путем непосредственного взаимодействия с АФК, убихинол принимает еще и опосредованное, неявное участие в борьбе с клеточными вредителями. Убихинол восстанавливает другой важнейший жирорастворимый антиоксидант – витамина Е: убихинол взаимодействует с α-токофероксил радикалом с образованием убисемихинон радикала, который регенерируется за счет взаимодействия с другими радикалами или включения в Q-цикл дыхательной цепи (рис. 31).
Замечательно то, что антиоксидант убихинол, принимая на себя удар, может регенерироваться, вступая своей окисленной формой в Q-цикл, быстро восстанавливаясь в ходе постоянно идущего естественного процесса транспорта электронов в дыхательной цепи.
Таким образом, коэнзим Q является антиоксидантом клетки. Многие заболевания и общее старение организма связано с тем, что митохондрии не справляются с детоксикацией АФК. Поэтому изучение и возможное терапевтическое применение антиоксидантов (в частности, CoQ и его аналогов) представляет очень большой интерес. Можно попытаться распознать функцию CoQ, изменяя содержание CoQ внутри митохондрий, но для повышения концентрации CoQ в митохондрии необходимо адресовано ввести кофермент в изолированные митохондрии, клетки или же организмы. Вследствие гидрофобности и соответственно низкой растворимости в водной среде возникает проблема доставки CoQ и, следовательно, и его изучения in vitro.
Для повышения концентрации аналогов хинонов, животным в течение нескольких недель дают пищу обогащенную хинонами, так что во всех тканях устанавливается стабильная необходимая для исследований концентрация. Эти соединения могут с помощью кровотока равномерно распределяться в тканях; так их активные формы были обнаружены в наиболее подверженных окислительному стрессу тканях, то есть в мозге, печени, сердце и мышцах животных. При этом концентрация аналогов хинонов в митохондриях в несколько сот раз выше, чем в кровотоке. Аналоги хинонов при необходимости легко выводятся из тканей, возвращаясь опять в кровь и достаточно быстро экскрегируются из организма при отмене диеты.
Гидрофобность коэнзима определяется в первую очередь его боковой изопреноидной цепью. Менее гидрофобные, но по-прежнему активные производные CoQ могут быть получены путем замены длинной боковой цепи на более водорастворимые «хвосты». Такие производные CoQ широко используются в качестве электронных доноров и акцепторов при изучении ферментов и для повышения содержания коэнзима в митохондриях и клетках. Биологическая активность подобных искусственно синтезированных аналогов CoQ должна в значительной степени сохраняться, так как в передаче электронов участвует бензохиноновое кольцо, а боковая цепь выполняет только функцию заякоривания молекулы в мембране.
Для адресной доставки коэнзима Q в митохондрии перспективно использование конъюгатов с так называемыми липофильными катионами, в том числе с трифенилфосфонием.
Так, аналоги кофемента Q, ковалентно связанные с катионами трифенилфосфония, образуют ряд молекул (рис.34):
— MitoQ (mitochondria-targeted ubiquinone)-производное хинона, ковалентно связанное с катионом алкилТРР; MitoQ10 -хинол, у которого в качестве боковой цепи алкильная цепь из 10 углеродов с ТРР+ на конце.
— Mito Vit Q (mitochondria-targeted derivative of α-tocoferol),
— spin traps (Mito PBN, mitochondria-targeted derivative of the spin trap phenylbutylnitrone),
— TBTP, IBTP (тиоловые зонды),
— MitoDC81 (DNA alkylating reagent).
Рисунок 32: производные коэнзима Q
Липофильные катионы, несмотря на положительный заряд, имеют высокую растворимость в липидах, легко проходят через мембраны бислоя без участия ионофоров и аккумулируются в митохондриях в клетки, движимые высоким потенциалом митохондриальной мембраны. Подобное свойство обусловлено гораздо меньшей по сравнению с гидрофильными катионами типа Na+ энергией активации перехода иона из водной среды в липидное окружение. Эта энергия определяется электростатической и гидрофобной составляющими.
Основной вклад в электростатическую компоненту вносит энергия Бора, которая представляет собой вклад энтальпии, необходимый для удаления гидратирующих катион молекул воды при переносе в липидную фазу из водного раствора. Энергия Бора обратно пропорциональна ионному радиусу катиона, что обусловлено пониженной гидратацией катиона при распределении заряда по большей площади поверхности, которая в этом случае имеет меньшую напряженность электрического поля, поляризующего молекулы воды. Липофильные катионы представляет собой фосфоний, окруженный тремя гидрофобными фенильными группами, за счет чего имеют большойим ионныйм радиус около 4 Ǻ. Таким образом, включение в мембранный бислой липофильных катионов типа тетрафенилфосфония с большим ионным радиусом в 4, 2 Ǻ гораздо менее энергетически невыгодно, чем поглощение маленьких катионов типа Na+ с радиусом ~1 Ǻ.
Помимо энергии Бора существует еще две электростатических составляющих, но которые вносят значительно меньший вклад. Первая обусловлена электростатическими свойствами на границе раздела фаз с различной диэлектрической проницаемостью, а вторая связана с локальным электрическим потенциалом, возникающим во внутренней части мембраны благодаря ориентации диполей карбонильных групп жирных кислот в фосфолипидах. Существование этой дипольной силы объясняет факт о значительно более быстром проникновении анионов сквозь бислой по сравнению с катионами.
В целом электростатические силы препятствует переносу катиона из водной в липидную фазу. Однако существует не менее важная компонента энергии перемещения, обусловленная гидрофобностью катиона. Она способствует включению его в бислой за счет положительного гидрофобного эффекта, который заключается в повышении энтропии, связанном с нарушением структуры воды. Гидрофобный эффект оценивается примерно в 92 Дж/моль на Ǻ2 доступной растворителю поверхности, и, к примеру, для тетрафенилфосфония выигрыш в энергии составит порядка 29 кДж/моль. Помимо этого, гидрофобный эффект возникает сразу после поглощения катиона мембраной, тогда как увеличение отталкивающих электростатических сил возникает постепенно при прохождении через мембрану. Вследствие этого в энергетическом профиле перемещения катиона сквозь бислой помимо центрального энергетического барьера имеются потенциальные «ямы» рядом с поверхностью мембран. Катионы связываются с мембраной, попадают в потенциальную «яму» у поверхности и быстро проходят сквозь гидрофобный центр к противоположной потенциальной «яме», после чего десорбируются в раствор по другую сторону барьера. Таким образом, катионы находяться в динамическом равновесии между формами, связанными с поверхностью внутренней мембраны и свободными формами в растворе, при этом в связанном состоянии находиться примерно 60% ТРМР и 85% тетрафенилфосфония (ТРР). Т.е. в перемещении липофильных катионов через фосфолипидный бислой можно выделить три стадии: адсорбцию, транслокацию и десорбцию (рис.33).
Рисунок 33: Накопление MitoQ10 в митохондрии в ответ на мембранный потенциал Δψ.
Связывание производных трифенилфосфония происходит в большей степени по мере роста гидрофобности боковой цепи из-за увеличения движущей силы энтропийной природы. К примеру, константа ассоциации с бислоем увеличивается в 10 раз при пере-ходе от ТРМР к амилТРР и в 6 раз при переходе к тетраТРР. При этом для всех производных группа ТРР ассоциируется с мембраной в одном и том же положении на гидрофобной стороне раздела липид/вода при одновременном проникании боковой цепи в мембрану, поэтому даже самые гидрофобные производные ТРР быстро проходят сквозь бислой, не задерживаясь в нем из-за липофильности алкильной цепи. Это подтверждается коэффициентами распределения производных ТРР в системе октанол/фосфатный буфер, имитирующей внешний мембранный слой, которые относительно велики: 0,35 у ТРМР и 160 у MitoQ10. При этом коэффициент распределения в имитирующей середину бислоя с низкой диэлектрической постоянной системе циклогексан/вода для MitoQ10 незначителен.
Таким образом, в отсутствии мембранного потенциала в условиях деэнергизованных митохондрий катионы связываются с наружной стороной мембраны, затем преодолевают гидрофобный энергетический барьер липидного бислоя, сявзываются с внутренней стороной мембраны и, наконец, десорбируются в митохондриальный матрикс.
При наличии Δψ перемещение катионов через мембрану приводит к их накоплению в митохондриальном матриксе в соответствии с уравнением Нернста. При Δψ около 60 мВ концентрация катионов в матриксе увеличивается в 10 раз, а при митохондриальном Δψ в 140-180 мВ – в сотни раз (рис. 36).Мера накопления катионов в ответ на мембранный потенциал Δψ описывается уравнением Нернста, где z — это заряд на катион.
При этом уравнение Нернста оперирует концентрациями несвязанных катионов. Значительная часть проникших в митохондрии катионов ТРР связана с внутренней мембраной, что обусловлено большим объемом внутренней мембраны по сравнению с объемом матрикса. Повышение гидрофобности производного приводит к увеличению адсорбции.
В свете описанных свойств катионов ТРР+, ковалентное присоединение незаряженных биологически активных соединений к катионам ТРР+ должно приводить к их адресной доставке внутрь митохондрий под действием высокого мембранного потенциала, что позволит исследовать различные вещества и использовать их в терапевтических целях. Рассмотрим некоторые производные хининов поподробнее.
Так аналоги кофемента Q, ковалентно связанные с катионами алкилтрифенилфосфо-ния, образуют молекулы MitoQ (рис.32), которые имеют различную длину боковой цепи.
Так, например, MitoQ10 – это хинол, у которого в качестве боковой цепи алкильная цепь из 10 углеродов с ТРР+ на конце (рис.32). Эксперименты в данном направлении на изолированных митохондриях и клетках показали, что MitoQ10 эффективно накапливается в митохондриях, включаясь во внутреннюю митохондриальную мембрану со стороны матрикса. Изопреноидный хвост CoQ располагается в центре бислоя параллельно поверхности, заякоривая молекулу внутри мембраны; бензохиноновое кольцо CoQ также погружено в мембрану, но способно менять свою пространственную ориентацию, тем самым, обеспечивая перенос электронов. Молекула же MitoQ ориентирована иначе: бензохиноновое кольцо локализуется в толще бислоя, изопреноидный хвост перпендикулярен поверхности мембраны, а объемный катион ТРР находится на поверхности мембраны, обращенной в матрикс (рис. 35). Для гомологов CoQ c достаточно длинной боковой цепью молекулярная динамика и минимизация энергии показали свернутую структуру молекулы: последняя изопреноидная единица находится в тесном контакте с бензохиноновым кольцом.
Рисунок 35: Ориентация CoQ и MitoQ оносительно мембранного бислоя.
Mito Vit Q – это аналог кофемента Q, являющийся производным α-токоферола (рис.32). Поскольку и CoQ и витамин Е проявляют антиоксидоньные свойства и предотвращают перекисное окисление липидов, то был синтезирован аналог убихинона Mito Vit Q. in vitro показано, что Mito Vit Q быстро и избирательно аккумулируются в изолированных митохондриях и в митохондриях изолированных клеток.
Таким образом, катионы ТРР (трифенилфосфония), связанные с антиоксидантами и другими зондами, избирательно направляют их (связанные с ТРР молекулы) в митохондрии внутри клеток и in vivo. Это использует для изучения окислительного повреждения и, возможно, лечения вызываемых АФК заболеваний.
Ученые стремились улучшить количество и селективность доставки антиоксидантов в митохондрии iv vivo, заменив липофильный монокатион на дикатион (рис.30), который теоретически должен был быть значительно более эффективным. Подобное предположение возникло исходя из уравнения Нернста: на каждое повышение мембранного потенциала на 60мВ дикатионы накапливаются 100-кратном размере внутри митохондрии, (по сравнению с деситекратным увеличение для монокатионов), давая 100-1000 кратное увеличение по сравнению с монокатионами. Подобное увеличение было бы весьма значительным в усовершенствовании разрабатываемой терапии.
Рисунок 36: Моно- и дикатионы трифенилфосфония
После проведения ряда экспериментов стало ясно, что дикатионы накапливаются в митохондриях при повышении мембранного потенциала примерно на 90-100мВ. Потому нецелесообразно применять дикатионы в роли векторов для доставки антиоксидантов в митохондрии. При низком мембранном потенциале (in vitro) дикотионов значительно больше нежели монокатионов, поэтому дикотионы могут использоваться для измерения мембранного потенциала.
Представляет очень большой интерес изучение как функций и механизмов действия естественных антиоксидантов клетки, так и их аналогов и дальнейшее возможное их терапевтическое применение. Окислительный стресс с накоплением в тканях и биологических жидкостях АФК и вторичных продуктов оксидативно модифицированных молекул обнаружены при многих (более 60) болезнях и патологических синдромах, нередко называемых свободно-радикальной патологией: старении тканей и всего организма, различных злокачественных процессах, хроническом воспалении (ревматоидный артрит, гастрит и язва, колиты, цистит и другие), СПИДе, сахарном диабете, атеросклерозе, последствиях инфаркта и инсульта, катаракте, нейродегенеративных заболеваниях (паркинсонизм, болезнь Альцгеймера и другие) и многих других. Вот только первично ли возникновение АФК или же накопление их является следствием патогенеза пока не совсем ясно. Несомненно, что избыточность АФК повреждает клетки и тем самым способствует развитию заболеваний, поэтому-то и необходимо изучение и создание новых неприродных антиоксидантов, которые совместно с клеточными антиоксидантами могли бы поддерживать АФК на допустимом для нормального фнкционирования клетки уровне.
Повышенные потребности тканей в кислороде
Если потребности тканей в кислороде повышаются, а их кровоснабжение не
может возрасти в должной степени, то наступает снижение РО2 в тканях, капиллярной и венозной крови.
В
качестве примера можно привести лихорадку или
тиреотоксикоз у больных с ограниченным
сердечным выбросом (например, при
аортальном стенозе ). Внешний вид больных при этом обычно совсем не
такой, как при других видах гипоксии . Цианоза обычно не бывает — наоборот, кожа теплая и
кровоток в ней увеличен (для повышения теплоотдачи).
Физическая нагрузка — классический
пример повышенных потребностей в кислороде. В норме они обеспечиваются
одновременной работой нескольких механизмов:
— увеличением сердечного
выброса и увеличением вентиляции легких, то есть общей доставки кислорода к
тканям;
— перераспределением кровотока в пользу работающих мышц за счет
неработающих мышц, кожи и внутренних органов (путем гуморального расширения
артериол работающих мышц и рефлекторного сужения артериол других органов);
— повышенной экстракцией кислорода из крови с увеличением
артериовенозной разницы по кислороду и
— уменьшением рН в тканях и
капиллярной крови, увеличивающим диссоциацию оксигемоглобина .
Превышение
возможностей этих механизмов приводит к
гипоксии преимущественно работающих мышц.