Биологический цикл азота
Азот составляет 80% земной атмосферы. Это основной элемент, необходимый для развития растений, он входит в состав любых белков, любой протоплазмы; чаще всего он усваивается в виде ионов NH4 или N03«. Последние быстро восстанавливаются ферментативным путем в аммонийные соединения. Ионы аммиака и некоторые углеводы, синтезированные в листьях, превращаются в аминокислоты главным образом в самих листьях.
Газообразный азот (N2, или N=N) химически инертен, он не может быть непосредственно использован растениями, животными и большинством микроорганизмов. Его запасы в атмосфере практически неисчерпаемые, однако только специфическая группа микроорганизмов может связывать атмосферный азот — азотфик- сирующие бактерии. Этот процесс называется азотфиксацией.
Азотфиксация в природе осуществляется свободноживущими {несимбиотическая азотфиксация) бактериями и бактериями, существующими в сообществе с растениями {симбиотическая азотфиксация). Считается, что бактерии переводят в связанную форму приблизительно 1 млрд т азота в год.
Промышленный синтез аммиака из азота и водорода (или «фиксация азота») идет в присутствии катализаторов при температуре около 500°С и давлении около 300 атм; составляет он не более 5% фиксированного азота нашей планеты, т.е. около 90 млн т. Поэтому значение биологической азотфиксации для жизни на планете огромно.
Несимбиотическая азотфиксация осуществляется бактериями в объеме приблизительно 20 мг азота на 1 г использованного сахара (как это отмечается у Azotobacter). Способность к фиксации молекулярного азота присуща многим бактериям: аноксигенным фототрофным бактериям, многим цианобактериям, факультативным анаэробам, хемолитоавтотрофным бактериям, метилотроф- ным, сульфатредуцирующим и метанообразующим бактериям. Особенно эффективно связывают азот атмосферы бактерии рода Azotobacter.
Впервые чистую культуру азотфиксаторов выделил С.Н. Виноградский в 1893 г. Это была анаэробная спорообразующая палочка— Clostridium pasteurianum. В 1901 г. голландский микробиолог М. Бейеринк обнаружил аэробную бактерию, способную фиксировать молекулярный азот, — Azotobacter chroococcum.
Связывание азота — это восстановительный процесс, и первым его продуктом, который можно обнаружить, является аммиак. Процесс восстановления происходит на ферментном комплексе — нитрогеназе.
Нитрогеназа состоит из двух компонентов: белка, в состав которого входит Mo, Fe и S, и белка, содержащего Fe и S. Их еще называют «компонент I» (или Мо — Fe-белок) и «компонент II» (или Fe — S-белок). Фермент крайне чувствителен к молекулярному кислороду.
Симбиотическая фиксация азота осуществляется бактериями в симбиозе с высшими растениями. Это так называемые клубеньковые бактерии(Rhizobium), впервые выделенные в 1888 г. М. Бей- еринком. Они обладают важными свойствами: вирулентностью — способностью входить в контакт с растением, проникать в ткани корня и вызывать образование клубеньков, и активностью, или эффективностью, т.е. способностью в симбиозе с бобовыми растениями усваивать молекулярный азот. Фиксация азота возможна и эффективна в том случае, если растение заражает (инокули- рует) вирулентная культура Rhizobium, если она конкурентоспособна в почве, для нее созданы оптимальные условия жизнедеятельности: влажность, аэрация, pH, доступные формы фосфора, калия, микроэлементов, особенно кобальта и молибдена (рис. 6.3). При свободном существовании в почве эти аэробные палочки растут как сапротрофы за счет органических соединений. По специфичности, или избирательности, в отношении растения-хозяина различают несколько видов клубеньковых бактерий.
В современной классификации ризобии, с которыми образуется эффективный симбиоз, выделяют Azorhizobium, Rhizobium, Sinorhizobium (быстрорастущие) и Bradyrhizobium (медленнорастущие). Заражение растения происходит только через молодые корневые волоски.
Азотфиксирующие бактерии обнаружены у большого числа небобовых растений; у древесной и кустарниковой растительности (ольхи, облепихи) клубеньки образуют азотфиксирующие актино- мицеты (в большинстве случаев), у травянистой (злаковые, осоковые и др.) — бактерии. У водного папоротника Azolla, растущего на поверхности стоячих тропических водоемов, азотфиксирующие цианобактерии содержатся в полостях листьев.
Фиксированный бактериями азот используется растениями и превращается в растительный белок. Растения, в свою очередь,
Рис. 6.3. Инокуляция клубеньковыми бактериями семян козлятника восточного (производственный посев, Московская обл., Ступинский р-н):
а — растение после инокуляции; б — контроль (без инокуляции)
(фото О.Д. Сидоренко)
поедаются животными, образуя животный белок. Большая часть белков попадает в почву с остатками отмерших растений, животных и микроорганизмов. При разрушении белков микроорганизмами азот освобождается в виде аммиака. Этот процесс называется аммонификацией.
В разложении белков участвуют многочисленные грибы и бактерии, в том числе бациллы, псевдомонады, протеи и др. Они обладают протеолитическими ферментами (протеазами и проте- иназами), которые расщепляют белки до конечных продуктов: в аэробных условиях — до С02, NH3, сульфатов и воды; в анаэробных — до аммиака, аминов, диоксида углерода, органических кислот и веществ с неприятным запахом: индола, скатола, сероводорода.
Если в почве достаточно кислорода, то аммоний, образующийся в почве, навозе и других природных источниках, подвергается нитрификации. Этот процесс осуществляют две группы микроорганизмов, соответственно окисляя аммиак до нитрита (первая фаза нитрификации) и нитрит до нитрата (вторая фаза нитрификации). Этапность процесса нитрификации — пример пищевых связей бактерий метабиоза N : Н. С.Н. Виноградский выделил и описал нитрифицирующие бактерии в 1890—1892 гг. Частично нитрификация осуществляется и при участии гетеротрофных бактерий, образующих нитрит из аммония, и грибов, способных окислять аммоний до нитрата.
Интенсивность нитрификации характеризует агрономические свойства почвы. Однако нитраты легко выщелачиваются из почвы (вымываются), что обедняет запас азота в почве. Для предотвращения потерь снижают интенсивность процесса нитрификации благодаря специфическим ингибиторам, подавляющим активность нитрифицирующих бактерий. В почве минеральный азот может потребляться микроорганизмами, включаясь в состав аминокислот, белков и других соединений. Этот процесс называется иммобилизацией азота, т.е. это процесс, обратный минерализации. Биологически закрепленный азот не теряется из почвы.
Связанный азот, необходимый для растений, удаляется из почвы также в процессе денитрификации, идущем с освобождением газообразного азота. С планетарной точки зрения этот процесс имеет решающее значение для сохранения жизни на земной суше. Без денитрификации земной и атмосферный запасы азота сосредоточились бы в виде солей в океане.
Потери ценных для растений минеральных азотных соединений наиболее существенны в переувлажненных почвах. Процесс денитрификации осуществляют в основном микроорганизмами родов Pseudomonas и Paracoccus. В отсутствие кислорода бактерии из нитрата, используемого в качестве акцептора водорода, образуют молекулярный азот.
Известно «нитратное дыхание» для целого ряда факультативно анаэробных бактерий (Enterobacter). Этот процесс отличается от денитрификации тем, что здесь протекает только первая ступень — восстановление нитрата до нитрита помощью нитратредуктазы А, при этом нитрит может накапливаться в культуральной жидкости, образование молекулярного азота не происходит.
Два века назад выдвинута гипотеза восстановления нитратов растительными организмами, и в настоящие время она является общепринятой теорией, хорошо обоснованной экспериментальными данными.
Круговорот азота (рис. 6.4) в экосфере сопряжен с круговоротом углерода, так как соотношение между этими элементами в составе глобальной биомассы постоянно: С : N = 55 : 1. Соответственно, и круговорот азота составляет около 1 Гт/год. Он замкнут настолько, насколько постоянны общая биомасса и состав экосферы, так как доступные для биоты резервуары связанного азота в почве и воде достаточно велики по сравнению с круговоротом — приблизительно 40:1.
Рис. 6.4. Цикл азота
Аммонификация
Мочевина и мочевая кислота разлагаются бактериями, грибами и актиномицетами, обладающими ферментом уреазой. К специфическим уробактериям относятся Nitrosococcus urea, Sarcina urea и др.
В результате гидролиза мочевины образуется аммиак и двуокись углерода:
Этот процесс является необходимым звеном в природном круговороте азотсодержащих соединений, так как растения не могут усваивать азот мочевины.
Процесс аммонификации в быту известен как «гниение», поскольку при этом происходит накопление продуктов, обладающих неприятным специфическим запахом: сероводорода, метил меркаптана, первичных аминов, известных под названием «трупных ядов». Роль гнилостных бактерий в природе огромна. Доля белка в тканях умерших животных и растений велика, и эти микроорганизмы осуществляют минерализацию белков, разлагая их в конечном итоге до С02, NH3 и H2S.
Нитрификация
Аммонийный азот, образующийся в результате аммонификации азотсодержащих соединений, в природных условиях может потребляться растительными организмами для построения клетки или окисляться бактериями до нитритов и нитратов в процессе нитрификации. В окислении аммония всегда участвуют две группы микроорганизмов: одни окисляют аммоний, образуют нитрит, а другие окисляют нитрит в нитрат.
Нитрификация осуществляется нитрифицирующими, автотрофными микроорганизмами, принадлежащими к семейству Nitrobacteriaceae.
По характеру окисляемых субстратов нитрифицирующие бактерии семейства Nitrobacteriaceae делятся на две группы:
первую стадию нитрификации — окисление аммонийного азота до нитритов осуществляют бактерии родов Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira, Nitrosolobus, Nitrosovibrio;
вторую стадию — окисление нитритов до нитратов — бактерии трех видов: Nitrobacter, Nitrospira, Nitrococcus (табл. 6.1).
ВИДЫ НИТРИФИЦИРУЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ
Виды Nitrosocystis обладают уреазной активностью и могут расти на мочевине, Nitrosomonas не обладает этим свойством. Nitrosomonas еиюраеа способен расти на гидроксиламине.
Все представители семейства Nitrobacteriaceae — одноклеточные грамотрицательные хемолитоавтотрофные организмы. По отношению к кислороду нитрифицирующие бактерии являются облигатными аэробами.
Нитрифицирующие бактерии получают энергию для своего роста за счет окисления неорганических соединений азота. Хемо- литоавтотрофы образуют клеточный материал из С02, восстановление которого происходит в цикле Кальвина. Необходимую для этого энергию и восстановительные эквиваленты в виде НДД(Ф)Н извлекают при окислении строго определенного для каждой группы субстрата. Основной возбудитель второй фазы нитрификации Nitrobacter замечателен своим строго специализированным энергетическим метаболизмом: энергию получает только за счет окисления нитритов. Поскольку нитрификаторы могут существовать без органического вещества, то они встречаются и там, где другие организмы не выживают.
Виды рода Nitrobacter — факультативные литоавтотрофы. Они могут расти облигатно с нитритами в качестве донора электронов или за счет окисления простых органических соединений. В ано- ксигенных условиях они могут использовать пируват или водород в качестве донора электронов с нитратами в качестве акцептора электронов.
В ходе окисления NH4 до N02‘ с помощью МН4 -окисля- ющих бактерий образуется также N20. Поэтому нитрификация представляет биологический источник атмосферного N20.
При окислении аммиака до нитрита в качестве промежуточных продуктов образуются гидроксиламин (NH2OH, реакция катализируется ферментом монооксигеназой) и, предположительно, гипонитрит (NOH) и окись азота (N0). При образовании нитрита молекулярный кислород служит обязательным конечным акцептором электронов.
Нитрификаторы отличаются повышенным содержанием ци- тохромов (с) и (а). Удельное содержание цитохромов в них выше, чем в таких богатых цитохромами органеллах, как митохондрии сердца.
Кроме МН4 -окисляющих бактерий в процесс окисления NH4 вовлечены другие микроорганизмы. Процесс окисления NH4 до N02~ могут осуществлять, например, также метанотрофные бактерии. При этом наблюдается также образование N2OH, осуществляемое метанмонооксигеназой. При повышенных концентрациях метана наблюдается подавление нитрификации — возможно, вследствие конкуренции за кислород между метанотрофами и бактериями, окисляющими аммоний, и/или конкуренции за минеральный азот между этими двумя группами микроорганизмов.
Нитрификация может проходить на различных солях аммония — как неорганических, так и органических. В присутствии Pseudomonas происходит полная нитрификация гипоксантина и ксантина, потребляются углеродсодержащие части молекул аллан- тоина, гипоксантина и ксантина. Важную роль нитрификаторы выполняют в сточных водах. Совместно с денитрификаторами их деятельность способствует удалению неорганического азота из стоков. Нитрификация может осуществляться в любых аэрирующих сооружениях биологической очистки: в аэротенках, смесителях и вытеснителях, на биофильтрах и биодисках различных конструкций, в сооружениях с псевдоожиженным слоем. В очистных сооружениях одного из исследуемых предприятий ]ЧН4 -окисляющие бактерии составляли около 20% от всех бактерий. Поступление в водоемы азотсодержащих городских и промышленных сточных вод и поверхностного стока стимулирует рост автотрофных нитрифицирующих бактерий.
Суммарное стехиометрическое уравнение нитрификации можно представить следующим образом:
Энергетическая реакция первой фазы нитрификации имеет
вид
второй фазы нитрификации:
Общая энергетическая реакция нитрификации:
Синтез клеточного вещества при нитрификации (или конструктивный обмен) осуществляется следующим образом:
Теоретический выход беззольного вещества Nitrosomonas на 1 мг окисленного азота составляет 0,147 мг, a Nitrobacter при полном окислении азота до нитратов составляет 0,167 мг/мг азота; при окислении нитритов до нитратов — 0,02 мг/мг азота.
По стехиометрическим расчетам кислорода на нитрификацию расходуется: на первую фазу нитрификации — 3,15 мг/мг азота; на вторую фазу 1,11 мг/мг азота; общее потребление кислорода — 4,26 мг/1 мг азота.
Нитрификация сопровождается образованием ионов водорода. Степень снижения pH зависит от щелочности среды, обусловливающей выделение или связывание С02, буферной емкости воды и окисленного количества аммония.
При функционировании нитрификаторов в системах биологической очистки типичное время удвоения биомассы нитрификаторов составляет около 1 сут.
На скорость нитрификации влияют температура, pH, концентрация аммонийного азота, соотношение органических веществ и азота, окислительно-восстановительные условия среды.
Нитрифицирующие бактерии развиваются в интервале pH 7,5—8,0. При значениях pH меньше 6 и выше 9,2 рост прекращается. С увеличением pH наблюдается превышение скорости окисления аммония над скоростью образования нитратов. В почве оптимальные условия для нитрификации NH3: температура около 30°С, pH — слабо щелочная. Для хорошо удобренных почв (рН0ПТ 8,6—9,2) характерны Nitrosomonas; для лесных почв (рНопт7,4—7,8) типичны Nitrosocystis; штаммы Nitrosospira встречаются только в бедных целинных почвах (рНопт7,0—7,2). Численность нитрификаторов в почве — около нескольких тысяч на 1 г плодородной пахотной почвы. Численность зависит от количества NH4 в почве.
При очистке сточных вод температурную зависимость можно выразить экспоненциальным уравнением
где цтах(Т) — максимальная скорость роста при температуре ТС; цтах(15) — максимальная скорость роста при 15°С.
Для деятельности нитрификаторов важен окислительно-восстановительный потенциал (гН2). Для нитрификаторов первой фазы оптимальное значение гН2 составляет 21,6, для нитрификаторов второй фазы — 23.
Растворимые органические вещества в концентрациях, усваиваемых гетеротрофными бактериями, в условиях жидкой культуры угнетают нитрификаторов. Поэтому в средах с высоким содержанием легкодоступного органического вещества окисление NH4_ нитрификаторами обычно начинается после использования гетеротрофными микроорганизмами органического вещества и роста концентрации растворенного кислорода в среде. Чувствительность нитрифицирующих бактерий к органическим веществам характерна только для жидких культур, т.е. при выращивании этих бактерий на жидких питательных средах или при развитии их в водоемах и водотоках. При высоких концентрациях сахаров в среде нитрификация приостанавливается, но клетки сохраняют свою жизнеспособность и при перенесении их в минеральную среду интенсивно нитрифицируют. При развитии нитрификаторов в почве угнетения нитрификации не наблюдается. Это объясняется тем, что нитрификация тормозится присутствием только водорастворимых органических веществ, способных проникать в клетки нитрифицирующих бактерий. Таких веществ в почве не бывает в большом количестве. Это позволяет нитрификаторам активно развиваться.
Ингибиторами нитрификации являются также фенолы и ро- даниды, причем ингибирующее действие фенолов проявляется в минимальных количествах, а роданидов — в десятки и сотни раз больших. Существуют данные об ингибирующем влиянии на нит- ритные бактерии и незначительных концентраций фенола (несколько мг/л) и сохранении активности нитратных бактерий в присутствии 100 мг/л фенола.
Многие вещества нашли практическое применение как ингибиторы нитрификации уреазы (при внесении мочевины) для предотвращения потерь азота в почве. Среди них производные пиридина, пиримидина, тиазола, дициандиамид (дидин, ДЦД), 1-карбамоил-3(5)-метилпиразол, 4-амино-1,2,4-триазол, CS2, хлорпиколиновая кислота, нитрапирин, производные пиразола. Сильным ингибитором аммониймонооксигеназы нитрифицирующих бактерий является С2Н2, который, однако, не влияет на гетеротрофную нитрификацию.
Потребности нитрификаторов в микроэлементах изучены мало. При добавлении железа стимулирующий эффект начинается с 0,1 мг/л для Nitrosomonas и 0,3 мг/л для Nitrobacter, оптимум для обоих видов — 6 мг/л. Бактерии нуждаются в магнии и фосфоре; молибден и вольфрам в присутствии железа стимулируют процессы окисления нитритов в нитраты культурами Nitrobacter.
Нитрифицирующие бактерии не способны окислять соединения серы, и наоборот, серобактерии не окисляют соединения азота.
Денитрификация
Денитрификация (диссимиляционная нитратредукция) — процесс восстановления азота нитратов до молекулярного азота или закиси азота с помощью микроорганизмов — денитрификаторов, относящихся к факультативным аэробам. Диссимиляторное восстановление нитратов вообще и денитрификация в частности осуществляются главным образом в клетках прокариот и представляют собой использование микроорганизмами нитратов в процессе дыхания в анаэробных условиях (анаэробное дыхание) в качестве терминальных акцепторов электронов. Денитрифицирующие бактерии способны восстанавливать также нитриты, окись и закись азота и молекулярный кислород. Денитрифицирующие бактерии являются гетеротрофными организмами, они нуждаются в органических соединениях как источнике углерода для их метаболизма. Эти органические соединения должны быть биологически легко деградируемыми для обеспечения достаточной степени денитрификации.
Денитрификаторы являются факультативными аэробами, так как могут расти и размножаться как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Однако обычно денитрификация интенсивнее идет при ограниченном доступе кислорода. В этом случае акцептором водорода, отщепляемого от окисляемого субстрата, служит только кислород нитрата. Однако и в аэробных условиях процесс денитрификации может осуществляться, но идет более медленно, так как при этом акцептором водорода наряду с кислородом нитратов является также и кислород воздуха. В анаэробных условиях большинство денитрифицирующих бактерий, в отличие от других альтернативных анаэробов, не переходят к осуществлению брожения, а продолжают процесс дыхания.
Микроорганизмы могут использовать нитрат для двух целей.
- 1. Извлекают из него азот для синтеза азотсодержащих клеточных компонентов. Такая ассимиляционная нитратредукция может протекать как в аэробных, так и в анаэробных условиях.
- 2. Возможна диссимиляционная нитратредукция, или «нитратное дыхание», при этом нитрат в анаэробных условиях служит конечным акцептором электронов. Этот процесс носит название истинной денитрификации.
Ассимиляция нитрата описывается уравнением
Реакция происходит по схеме
При диссимиляционной нитратредукции происходит восстановление нитрата через нитрит до газообразной закиси азота N20 и азота N2 по уравнению
Восстановление происходит по схеме
Каждый этап катализирует соответствующая редуктаза. В обоих случаях нитраты сначала восстанавливаются до нитритов при помощи молибденсодержащего фермента нитратредуктазы. Нитриты могут затем восстанавливаться до аммония через ассимиляционный путь, или они могут быть восстановлены до N2 или N20 через диссимиляционный путь. Для многих денитрификаторов акцептором электронов могут служить не только нитраты, но и нитриты, а водородная бактерия Paracoccus denitrificans восстанавливает и закись азота N20.
При восстановлении нитрата в ряде случаев кроме N2 и N20 может образоваться окись азота NO. Конечные газообразные продукты денитрификации не используются в процессах метаболизма и выводятся из клетки.
Диссимиляционная нитратредукция сопряжена с генерацией градиента водородного иона на мембранах. В общем случае ферменты, ответственные за ассимиляционный путь, репрессируются высокими концентрациями аммония, в то время как диссими- ляционные редуктазы репрессируются 02 и синтезируются при анаэробных условиях.
Процесс денитрификации происходит в природных средах: в озерах и морях, в почве в две стадии. По мере исчезновения нитрата в обедненной кислородом среде накапливается нитрит (в начальной стадии восстановления нитрата в соотношении 1:1). Нитрит далее восстанавливается в газообразный азот или закись азота. В обычных условиях ассимиляционная нитратредукция протекает медленно, со скоростью, соответствующей потребностям клеток в аммонии при их росте. При этом нитриты как промежуточные продукты восстановления не накапливаются. При диссимиляционной нитратредукции нитраты используются как альтернативный акцептор электронов при получении энергии. Это более быстрый процесс, ведущий к быстрому и значительному накоплению нитритов.
Денитрификация, при которой происходит восстановление оксидов азота до газообразных продуктов (N20 и N2), имеет наиболее широкое распространение и в большинстве случаев происходит в анаэробных условиях. Восстановление нитратов до молекулярного азота нередко наблюдается в плотных и заболоченных почвах при возникновении в них анаэробных условий, когда содержание 02 падает ниже 0,2%. В водных средах наиболее важным, а часто и единственным продуктом денитрификации является молекулярный азот. Таким образом, диссимиляционная нитратредукция ведет к выделению фиксированного в среде азота в атмосферу. Этот процесс имеет отрицательное значение в почвах при использовании азотсодержащих удобрений. В результате денитрификации нитраты восстанавливаются до газообразного молекулярного азота. Мерой борьбы с денитрификацией является рыхление почвы, приводящее к созданию аэробных условий, что заставляет денитрифицирующие микроорганизмы переключаться на другой тип энергетических процессов, осуществляя транспорт электронов на молекулярный кислород, а не на нитраты.
При биологической очистке сточных вод денитрификация выполняет двоякую роль. С одной стороны, денитрификация является полезным процессом — ее используют для удаления азота из воды. С другой стороны, денитрификация затрудняет нормальную эксплуатацию вторичных отстойников аэротенков, поскольку частички активного ила насыщаются пузырьками газообразного N2и хуже отделяются от жидкости во вторичном отстойнике, нарушая нормальный режим работы отстойников.
До недавнего времени ассимиляция нитратов считалась функцией прокариот и была хорошо изучена на примере нескольких бактерий. Однако в последующем нитратредуктаза была найдена среди разнообразных, в том числе и таксономически очень отдаленных, видов, начиная от бактерий и до человека включительно. Она была выделена из различных растений, водорослей, грибов и микроорганизмов, и ее структура и регуляция описаны в многочисленных работах. С начала 1980-х гг. стало ясно, что ассимиляция нитратов распространена в природе более широко, чем это представлялось ранее, и этот процесс могут использовать при пониженном парциальном давлении кислорода не только бактерии, но и самые разнообразные эукариоты: дрожжи, грибы и высшие растения.
Хотя ассимиляционная нитратредукция встречается у всех растений и большинства видов грибов, а также у многих бактерий, диссимиляционная нитратредукция ограничена только бактериями. Однако среди бактерий этот процесс способны осуществлять многие виды. В то же время процесс денитрификации до сих пор был обнаружен только у факультативных аэробов. По-видимому, среди облигатных анаэробов нет денитрифицирующих форм.
Денитрификация идет в анаэробных условиях под действием многочисленных видов факультативных анаэробов, относящихся в основном к родам Pseudomohas, Bacillus, Micrococcus, Proteus, Alcaligenes, Neisseria и др. Среди различных денитрификаторов — бактерии Alcaligenes faecalis, Bacillus licheniformis, Hyphomicrobium vulgare, Paracoccus denitrificans, Pseudomonas stutzeri, Spirillum itersonii, Thiobacillus denitrificans. Денитрифицирующей способностью обладают и клубеньковые симбиотические азотфиксаторы Rhizobium (R. meliloti).
Подавляющее большинство денитрификаторов — хемооргано- трофы, использующие в качестве окисляемого субстрата углеводы, спирты, органические кислоты и другие органические соединения.
Полная цепь нитратного дыхания имеется у ограниченного числа микроорганизмов, так называемых истинных денитрификаторов. Имеются бактерии, например энтеробактерии, которые восстанавливают нитраты только до нитритов (нитрат-нитритное дыхание), другие могут восстанавливать только нитриты до молекулярного азота. Известны сульфатредуцирующие бактерии, использующие в качестве акцепторов электронов нитраты, нитриты и гидроксиламин. Восстановление Desulfobulbus propionicus нитратов ведет к образованию аммиака.
При проверке коллекции клубеньковых бактерий у ряда штаммов различных групп была показана способность к азотфиксации за счет энергии денитрификации в чистой культуре вне симбиоза в анаэробных условиях в присутствии нитрата. Ею обладали многие штаммы R. meliloti, а также отдельные штаммы R. leguminosarum, R. phaseoli.
Установлено, что 80% денитрификаторов в системах очистки сточных вод относится к роду Pseudomonas, около 9% — к Alcaligenes, а остальные, главным образом, к Achromobacter. Удаление из сточных вод нитратов осуществляют также микроскопические грибы рода Geotrichum в аэробных условиях.
Способность восстанавливать нитрат в системе реакций энергетического метаболизма, широко распространенная у бактерий, представляется менее необычной, если вспомнить, что бактерии, использующие в качестве источника азота нитраты (а таких много), должны иметь ферментную систему для его восстановления, так как в конструктивном метаболизме азот участвует только в восстановленной форме. Таким образом, восстановление нитратов и нитритов в системе реакций конструктивного метаболизма очевидно. Не исключено, что именно ферментативное восстановление нитратов для конструктивных целей легло в основу развития этой способности в энергетических процессах. Однако отождествлять оба процесса нельзя.
Сейчас установлено, что обе ферментные системы восстановления нитратов достаточно четко различаются. В частности, показана разная локализация процессов: ферменты, восстанавливающие нитраты в конструктивном метаболизме, локализованы в клеточной цитоплазме, а ферменты, восстанавливающие нитраты в энергетическом процессе, связаны со структурными элементами клетки, будучи встроенными в клеточные мембраны. Различна природа ферментативного восстановления нитратов в обеих системах: ферменты, катализирующие восстановление нитратов в конструктивном метаболизме, конститутивной природы, а в энергетическом — адаптивной. Синтез последних подавляется молекулярным кислородом.
У дрожжей нитратредуктаза локализована в цитоплазме и легко выделяется при разрушении клеток. К настоящему времени описаны свойства нитратредуктаз у Candida utilis, Candida boidini, Hansenula anomala, Rodotorula glutinis, Torulopsis nitratophila.
Нитратредуктаза E.coli — мембранный белок, состоит из четырех субъединиц (143, 85, 60, 26 кДа), включая цитохром Ь, фиксирующий фермент, подобно якорю, в мембране, содержит мо- либдоптерин, FeS-центры, протогем, взаимодействует с хинолом. Сходные свойства имеет нитратредуктаза других гетеротрофных бактерий, хотя имеется исключение — у Staphylococcus aureus обнаружены две формы фермента: мембранная и цитоплазматическая, неразличимые иммунологически. Восстановление ионов нитрата происходит на внутренней стороне плазматической мембраны бактерий.
Нитратредуктаза представляет собой классический пример индуцибельного фермента: ее синтез начинается в присутствии нитратов и прекращается сразу после их исчезновения из среды роста. Вместе с тем исследования последних лет показали, что у различных эукариот присутствуют также конститутивные нит- ратредуктазы, активность которых можно обнаружить в отсутствие нитратов или при росте на среде с аммонием. Конститутивные формы нитратредуктаз, как правило, имеют существенно более низкую активность, чем индуцибельные, и их физиологическая функция остается неясной.
При денитрификации происходит образование специальных типов цитохромов, связанных с мембранными ферментами систем, которые восстанавливают нитрат до нитрита и далее до молекулярного азота. Поток электронов при этом типе дыхания схематически можно изобразить следующим образом.
Нитратредуктазы диссимиляционного типа широко распространены у бактерий разных таксономических групп. Они бывают двух типов: медьсодержащие (Cu-dNir) и содержащие гемы с и dx (cdx — dNir).
Нитратредуктаза и редуктазы окиси и закиси азота сопряжены с электронтранспортной цепью на уровне цитохрома Ь. Нитратредуктаза, ответственная за диссимиляторное восстановление нитрата, — связанный с мембраной фермент, который восстанавливает нитрат до нитрита, получив электрон от цитохрома Ь:
Нитритредуктаза и редуктаза окиси азота при фракционировании клеток денитрифицирующих бактерий обнаруживаются как растворимые ферменты, сложные ферменты, каталитические центры которых содержат атомы железа, из которых одни входят в состав гема (серогем), а другие связаны с атомами серы:
Редуктаза закиси азота связана с мембраной:
Ключевым этапом денитрификации является необратимое восстановление N02_до N0 и N20.
При ассимиляционной нитратредукции образующийся нитрит восстанавливается до аммиака с помощью нитритредуктазы, на что затрачивается 6 электронов, поступающих от NAD(P)H2 (у грибов и бактерий). Нитритредуктазная реакция сходна с превращениями, катализируемыми нитрогеназой и сульфитредуктазой, когда при восстановлении субстрата происходит перенос 6 электронов.
У E.coli, восстанавливающей нитраты до аммиака в анаэробных условиях через диссимиляционный путь, NADН—зависимое восстановление нитритов с помощью цитоплазматической нитрит- редуктазы, снабжает хозяина потенциальным источником азота для роста, регенерации NAD из NADH, увеличивает pH в окружающей среде и удаляет токсичный продукт восстановления нитратов из цитоплазмы. Это наиболее активный путь восстановления для E.coli, обусловливающий по меньшей мере 50—96% от общей нитритвосстановительной активности при росте на глюкозе.
В процессе восстановления нитритов до аммония задействованы также два фермента: NADPH—зависимая сульфитредуктаза и формиат-зависимая нитритредуктаза. Вклад первого фермента в восстановление нитритов не превышает 5%. Второй фермент связан с мембраносвязанной электронтранспортной цепью и, вероятно, служит для удаления двух потенциально токсичных соединений: внеклеточных нитритов и внутриклеточного формиата. При функционировании этого фермента дополнительно генерируется протон-электрохимический градиент.
Поскольку выход энергии при денитрификации меньше (2386 кДж), чем при окислении кислородом (2872 кДж), при аэробных условиях все бактерии, способные осуществлять эти типы дыхания, предпочитают кислородное дыхание.
Использование в качестве конечного акцептора электронов нитратов позволяет денитрифицирующим бактериям окислять органические субстраты полностью (до С02 и Н20). Например, при росте Bacillus licheniformis на среде с глюкозой и нитратом в анаэробных условиях субстрат распадается по пути Эмбдена— Мейергофа—Парнаса. Образующийся при этом из пирувата аце- тил-СоА окисляется в цикле трикарбоновых кислот, давая НАДН2 и ФАДН2, поступающие в дыхательную цепь в качестве доноров электронов.
В качестве органического субстрата в процессе денитрификации могут быть использованы любые окисляемые органические соединения (углеводы, спирты, органические кислоты, продукты распада белков, избыточный активный ил, отходы производства гидролизного спирта и т.д.). При очистке сточных вод методом денитрификации источником углеродного питания могут служить исходные или прошедшие очистку в первичных отстойниках сточные воды, а также органосодержащие производственные сточные воды, предпочтительно не содержащие аммонийного, органического и белкового азота.
Органическое вещество в сточных водах может быть использовано как источник углерода, если оно легкодеградируемо. Иловая вода обычно не содержит легкоразлагаемых компонентов в достаточном количестве, и кроме того, органические соединения в сточных водах обычно обеспечивают низкую скорость денитрификации. Для достижения высокой скорости денитрификации в сточную воду должны добавляться легкоразлагаемые соединения. В таких системах очистки из индивидуальных соединений в качестве углеродного субстрата применяются уксусная кислота, ацетон, сахара, метан, аланин, лактат, цитрат натрия, метанол, этанол и др. Большой интерес вызвала схема денитрификации с использованием в качестве источника углерода метанола. В настоящее время за рубежом для биологической денитрификации используют десятки тонн метилового спирта в год. Особенность его использования заключается в том, что это соединение окисляется легко, продукты окисления не вносят дополнительных загрязнений в очищенную сточную воду, полное разделение процессов окисления С и N обеспечивает оптимальные условия развития специализированных культур ила. Считается, что основными агентами, вызывающими процесс денитрификации с метанолом, являются представители только двух родов — Hyphomicrobium и Рагасосст.
На активность денитрификации влияет много факторов: источник органического углерода и его концентрация; содержание нитратов, нитритов; соотношение количества органического углерода и количества нитратов; концентрация кислорода; температура воды; pH; окислительно-восстановительный потенциал; присутствие токсических веществ; условия засоления. Эти факторы по-разному влияют на скорость отдельных восстановительных процессов, приводя к различному составу промежуточных и конечных продуктов денитрификации.
Денитрификации благоприятствуют слегка щелочная реакция, тепло, недостаток 09 и достаточный запас органического вещества для обеспечения доноров электронов. Низкие значения pH (< 7) и повышенные концентрации растворенного кислорода приводят к подавлению синтеза и активности М20-редуктазы. При этом закись азота может оказаться главным (или единственным) конечным продуктом денитрификации.
Скорость денитрификации также зависит от температуры.
В очистных сооружениях удаление азота в сильной степени зависит от концентрации активного ила и концентрации акцепторов электронов и незначительно зависит от концентрации летучей части растворимого биодеградируемого субстрата.
Для деятельности денитрификаторов важен окислительно-восстановительный потенциал (гН2). Для денитрификаторов оптимальное значение гН2 составляет 13—14.
Значение гН2 в большей степени определяет условия процесса денитрификации при очистке сточных вод, чем отсутствие кислорода. Этот процесс может протекать при концентрации растворенного кислорода в иловой смеси более 4 мг/л при условии поддержания оптимального значения окислительно-восстановительного потенциала.
Можно создать условия, при которых будет идти только первая фаза нитрификации. При удалении азота из загрязненных стоков в этом случае можно достичь увеличения скорости денитрификации (образование N2 из N02‘ идет быстрее, чем из N03‘), сокращая потребности в 02 для нитрификации в 1,4 раза и уменьшая количество органического субстрата, требуемого для денитрификации (в 1,5 раза на стадии денитрификации).
Нитраты и нитриты в высоких концентрациях могут угнетать денитрификацию. Так, показано угнетение роста нитритом у Pseudomonas denitrificans при культивировании в перемешиваемом реакторе непрерывного действия на минеральной среде с уксусной кислотой. При pH 7,0 рост и метаболизм прекращались при концентрации нитрита 300 мг N/л.
Важную роль в природных средах и в системах биологической очистки денитрификация может выполнять при удалении стойких и токсичных органических загрязнений, особенно из сред в аноксигенных условиях с низким содержанием кислорода и высоким содержанием нитратов. При этом важно отсутствие угнетения процессов денитрификации со стороны токсичных для окружающей среды органических соединений.
В отсутствие кислорода нитраты могут участвовать в процессах аноксигенной деградации таких органических соединений, как толуол, ксилол, фенол. Однако скорость протекания таких процессов и спектр окисляемых загрязнений, как правило, ниже таковых в аэробных условиях, когда акцептором электронов является кислород. Бензол, в частности, нитратами не окисляется.
В настоящее время имеется мало данных, доказывающих возможность анаэробного пути деструкции углеводородов. Считают, что при отсутствии молекулярного кислорода углеводород теряет водород, образуя двойную связь, тогда как нитратный ион действует как конечный акцептор водорода. Имеются наблюдения об использовании н-октана и гексадекана в условиях анаэробного роста в присутствии в качестве конечного акцептора водорода нитратов.
М.В. Ивановым с соавторами из разных почвенных образцов был выделен ценоз термофильных денитрифицирующих микроорганизмов, способный к деструкции углеводородов нефти. Из этого ценоза была изолирована чистая культура, идентифицированная как Bacillus stearothermophilus. Кинетика роста и деградации нефти в жидкой среде имела две фазы. Первая фаза соответствовала активному росту культуры, а во второй фазе рост и деградация нефти не коррелировали между собой. Кинетика деградации нефти в почве соответствовала уравнению первого порядка со временем полураспада нефти 4,0 сут для почвы, инокулированной В. stearothermophilus, и 19,2 сут — для нативной загрязненной почвы. Соотношение количеств редуцированного нитрата и окисленных углеводородов составляло 1,25 г/г. Авторами сделан вывод, что микробная деградация углеводородов нефти в условиях, благоприятных для жизнедеятельности термофильных и денитрифицирующих микроорганизмов, может быть важным процессом в биологической очистке анаэробных почвенных и водных систем.
Таким образом, денитрификация, как составная часть цикла биохимических процессов трансформации азота, имеет важное значение для удаления азота и органических загрязнений из сточных вод, при использовании азотных удобрений и в системах биоремедиации природных сред.