— регуляция оксигенации — Биохимия

Сульфит натрия Na2SO3

Сульфит натрия является одним из самых доступных по цене  и наиболее активным химическим реагентом, использующимся в качестве поглотителя кислорода.

При взаимодействии сульфита натрия с растворенным кислородом образуется сульфат натрия, который накапливается, повышая солесодержание в котле:

2 Na2SO3 O2  = 2Na2SO4

Таким образом, при высоких значениях давления или других критических условиях эксплуатации котлов, где повышенное солесодержание нежелательно, применять сульфит натрия  не рекомендуется!

Из химической реакции следует, что примерно на 8 частей сульфита натрия приходится 1 часть растворенного кислорода.  При этом поддерживается концентрация сульфитов на уровне до 20 мг/л в котле.

При давлении выше 41 бар сульфит подвергается термическому разложению с образованием диоксида серы или сульфида серы:

Na2SO3 H2O → SO2 2 NaOH

4 Na2SO3 2 H2O → H2S 2 NaOH 3 Na2SO4

Оба этих газа, являясь коррозионноактивными, улетают вместе с паром из котла, понижая при этом значение pH пара и конденсата и вызывая при этом, угрозу возникновения коррозии в системе.

Таким образом, сульфит натрия эффективно связывает растворенный кислород, но не является летучим с паром реагентом, то есть, не обеспечивает защиту паро-конденсатного контура и не способствует переходу гематита в магнетит, то есть не обладает пассивирующими свойствами. 

Гидразин N2H4

Наиболее часто для котлов высокого давления в качестве реагента для связывания растворенного кислорода применяют гидразин и катализированный гидразин.

Гидразин не образует коррозионноактивных газов при высоких температурах и давлениях, и взаимодествует с кислородом с образованием азота и воды:

N2H4 O2 → 2 H2O N2

Из химической реакции следует, что примерно 1 часть гидразина связывает 1 часть растворенного кислорода. На практике применяют 100% избыток гидразина. При этом поддерживается концентрация гидразина на уровне 1 мг/л в котле.

Гидразин не повышает солесодержание в котловой воде, снижая при этом количество продувочной воды. Также, гидразин образует защитную пленку из магнетита на поверхности трубопроводов  и в барабане котла, то есть способствует пассивации. Однако, применение гидразина имеет ряд недостатков.

Во-первых, гидразин не является летучим с паром соединением, поэтому он не защищает весь паро-конденсатный контур от коррозии. При температурах выше 205ºС гидразин разлагается на аммиак, который улетает с паром, и в присутствии кислорода способствует развитию коррозии меди:

2 N2H4 → 2 NH3 N2 H2

Во-вторых, гидразин обладает канцерогенными свойствами и является опасным химическим соединением.  Гидразин и его водные растворы сильно ядовиты, раздражают слизистые оболочки, глаза и дыхательные пути, поражают центральную нервную систему и печень.

ФУНКЦИИ БЕЛКОВ

Знание трехмерной структуры белков очень важно для понимания их функций. Однако структура, изображенная на плоском листе бумаге, обманчиво статична. Белки — это динамичные молекулы, чьи функции почти всегда связаны с взаимодействиями с другими молекулами, а эти взаимодействия регулируются удивительными, иногда очень тонкими изменениями конформации белка.

В этой главе мы обсудим, каким образом белки взаимодействуют с другими молекулами и как эти взаимодействия связаны с динамической структурой белка. Вряд ли можно переоценить значение молекулярных взаимодействий для функционирования белков. В гл. 4 мы показали, что функция фибриллярных белков в качестве структурных элементов клеток и тканей зависит от устойчивых, длительных взаимодействий между идентичными полипептидными цепями.

В данной главе мы увидим, что функции многих других белков реализуются через взаимодействия со множеством различных молекул. Большинство этих взаимодействий мимолетны, тем не менее они могут быть основой сложных физиологических процессов, таких как перенос кислорода, иммунные реакции и сокращение мышц (эти три темы мы рассмотрим более подробно).

В функционировании многих белков важную роль играет обратимое связывание других молекул. Молекула, которая обратимо связывается с белком, называется лигандом.Лигандом может быть любая молекула, в том числе и другой белок. Краткосрочность взаимодействия белка с лигандом имеет важнейшее значение для жизни, поскольку позволяет организму быстро и обратимо реагировать на изменение внешних условий и метаболических процессов.

Участок связывания лиганда на молекуле белка называется центром связывания; он подходит соответствующему лиганду по размеру, форме, заряду, а также по гидрофильности (гидрофобности). Кроме того, это взаимодействие является специфическим: белок связывается всего с одним или несколькими типами молекул из окружающего его множества самых разных соединений.

Молекула белка может иметь центры связывания для нескольких различных лигандов. Подобные специфические взаимодействия играют важнейшую роль в поддержании упорядоченности в живых системах. Сейчас мы не будем обсуждать связывание воды, которая может участвовать в слабых и неспецифических взаимодействиях с белками. В гл. 6 мы отдельно остановимся на роли воды как специфического лиганда для многих ферментов.

Молекулы белков обладают большой гибкостью. Изменения их конформации могут быть едва различимыми и являться результатом внутримолекулярных колебаний и незначительных перемещений аминокислотных остатков в молекуле. Подобные изменения конформации иногда называют «дыханием» белка.

Связывание белка с лигандом часто сопряжено с конформационными изменениями в молекуле белка, в результате которых достигается лучшая совместимость лиганда с центром связывания, а, следовательно, и более надежное связывание. Структурные перестройки, которыми сопровождается взаимодействие белка с лигандом, называют индуцированным соответствием.

В белках, состоящих из нескольких субъединиц, конформационные изменения в одной субъединице часто влекут за собой изменения в другой субъединице.

Взаимодействие лигандов с белками может регулироваться, что обычно достигается посредством специфических взаимодействий с еще одним или несколькими лигандами. Эти дополнительные лиганды могут вызывать конформационные изменения в молекуле белка, влияющие на связывание первого лиганда.

Говоря о функциях белков, следует отдельно остановиться на ферментах. Ферменты связывают другие молекулы и способствуют их превращениям, т. е. катализируют реакции. Молекулы, подвергающиеся изменениям в ферментативных реакциях, называют не лигандами, а субстратами, а участок молекулы фермента, где протекает ферментативная реакция, называют каталитическим или активным центром.

В данной главе мы не будем останавливаться на каталитических функциях белков — этому важнейшему разделу биохимии посвящена гл. 6. Основные темы этой главы, а именно связывание, специфичность и конформационные изменения, будут развиваться в следующей главе в приложении к белкам, участвующим в химических превращениях.

1. Обратимое связывание белков с лигандами: белки, связывающие кислород

Возможно, миоглобин и гемоглобин являются наиболее хорошо изученными белками; для них впервые была определена трехмерная структура. Наши сегодняшние знания об этих белках — результат исследований, которые на протяжении нескольких десятилетий проводили тысячи биохимиков.

Важно отмстить, что на примере этих белков можно проиллюстрировать практически все ключевые аспекты основного биохимического процесса — обратимого связывания лиганда с белком. Эти классические модельные белки могут многое рассказать о том, как белки функционируют. Кислородсвязывающий белок миоглобин и депонирование кислорода

Кислород связывается с простетической группой — гемом

Кислород плохо растворяется в воде (табл. 2-3), и если бы сыворотка крови содержала только растворенный кислород, то его поступление в ткани было бы недостаточным. Кроме того, диффузия кислорода в тканях на расстояния свыше нескольких миллиметров также неэффективна.

Эволюция крупных многоклеточных организмов связана с возникновением белков, способных запасать и переносить кислород. Однако боковая цепь ни одной аминокислоты не годится для обратимого связывания молекулы кислорода. Эту функцию выполняют некоторые переходные металлы, в том числе железо и медь, обладающие высоким сродством к кислороду.

Поэтому многоклеточные организмы используют для транспорта кислорода ионы металлов, чаще всего железа. Свободные ионы железа способствуют образованию очень реакционноспособных соединений кислорода, таких как гидроксильные радикалы, способные повредить ДНК и другие макромолекулы.

Поэтому клетки используют железо в связанной форме, в которой оно менее активно. У многоклеточных организмов, особенно тех, в которых комплекс железа с кислородом должен переноситься на большие расстояния, железо часто встроено в связанную с белком простетическую группу — гем. (В гл.

Гем представляет собой сложную циклическую структуру, называемую протопорфирином, с которой связан ион железа Fе2 (рис. 5-1). Атом железа имеет шесть координационных связей: четыре связи образованы с атомами азота, являющимися частью плоского порфиринового кольца, а две связи направлены перпендикулярно плоскости порфиринового кольца.

Координационная связь с элсктронодонорными атомами азота препятствует окислению гемового железа до состояния Fe3 . Железо в форме Fe2 обратимо связывает молекулу кислорода, а железо в форме Fe3 не связывает кислород.

Рис. 5-1. Структура гема. Гем обнаружен в молекулах миоглобина, гемоглобина и многих других белков — гемопротеинов. Гем представляет собой сложную полициклическую структуру (протопорфирин IX), с которой связан атом железа в форме Fе2 . а) Порфирин IX является лишь одним представителем класса порфиринов, молекулы которых состоят из пиррольных колец, связанных метиновыми мостиками и несущих заместители в положениях, обозначенных буквой X. б, в)

В гемовой группе, не связанной с белком, Fe2 имеет две свободные координационные связи. Взаимодействие молекулы O2 с двумя молекулами гема (или двумя свободными ионами Fe2 ) может привести к необратимому превращению Fe2 в Fe3 .

В гемсодержащих белках эта реакция не происходит, поскольку каждый гем спрятан глубоко внутри белковой структуры и доступ к двум свободным координационным связям ограничен. Одна из этих связей направлена на атом азота боковой цепи остатка His. Другая служит центром связывания молекулярного кислорода (O2) (рис. 5-2).

При связывании кислорода свойства гемового железа изменяются; это, в частности, служит причиной изменения темно-красной окраски венозной крови на светло-красную окраску богатой кислородом артериальной крови. Некоторые небольшие молекулы, такие как монооксид углерода (СО) и монооксид азота (NO), имеют более высокое сродство к гемовому железу, чем молекула кислорода.

При связывании с гемом молекулы СО происходит высвобождение O2, вот почему СО (угарный газ) так токсичен для аэробных организмов (подробнее см. доп. 5-1). Окружая и изолируя гем, кислородсвязывающие белки регулируют доступ к нему СО и других небольших молекул.

Рис. 5-2. Координационные связи гемового железа (вид сбоку). Две координационные связи Fe2 направлены перпендикулярно плоскости порфиринового кольца. Одна из этих связей направлена на азот остатка His, иногда называемого проксимальным гистидином.

В миоглобине один участок связывания кислорода

Миоглобин (Мb) имеет молекулярную массу 16 700 и является сравнительно простым кислородсвязывающим белком, обнаруженным практически у всех млекопитающих преимущественно в мышечной ткани. Он служит транспортным белком, облегчающим доставку кислорода к мышцам.

количество кислорода. Аналогичные миоглобину белки очень широко распространены и встречаются даже у некоторых одноклеточных организмов.

Миоглобин представляет собой единственную полипептидную цепь из 153 аминокислотных остатков, связанную с одной молекулой гема. Он является типичным представителем семейства глобинов, все члены которого имеют сходные первичную и третичную структуры.

Рис. 5-3. Миоглобин (РDВ ID 1МВ0). Восемь α-спиральных участков молекулы (изображены в виде цилиндров) обозначены латинскими буквами от А до Н. Связывающие их участки обозначены как АВ, СD, ЕF и т. д. по названию тех спиралей, которые они соединяют. Некоторые связующие участки, такие как ВС или DЕ, очень короткие и не содержат ни одного остатка; обычно при изображении молекулы их не называют.

(Имеющий некоторую протяженность участок между спиралями D и Е в данном случае является артефактом компьютерного моделирования.) Гем связан в кармане, образованном главным образом спиралями E и F, хотя аминокислотные остатки других участков также задействованы в его формировании.

Любое детальное исследование функции белка обязательно связано с определением его структуры. На примере миоглобина мы обсудим некоторые особенности глобиновых белков. Как видно из рис. 5-3, спиральные участки молекулы обозначены буквами от А до Н. Отдельные аминокислотные остатки обозначены в соответствии с их позицией либо во всей полипептидной последовательности, либо в определенном α-спиральном участке.

Например, в молекуле миоглобина остаток гистидина, связанный координационной связью с гемовым железом, обозначен как His93 (93-й аминокислотный остаток, считая от N-конца полипептидной цени миоглобина); иначе он же обозначается как His F8 (восьмой остаток в α-спирали F).

Количественное описание взаимодействий белков с лигандами

Для выполнения своей функции миоглобин должен быть способен не только связывать кислород, но и высвобождать его по мере необходимости. При многих химических процессах происходят подобного рода обратимые взаимодействия белка и лиганда. Таким образом, количественное описание взаимодействия белка и лиганда является ключевым моментом многих биохимических исследований.

В общем случае обратимое связывание белка (Р) и лиганда (L) может быть описано простой обратимой ракцией:

Р L ⇄ PL (5-1)

Эта реакция, которая характеризуется константой равновесия Ка:

где ra и rd — это константы скорости (подробнее о них будет сказано ниже). Константа Ка — константа ассоциации (не путайте с константой диссоциации кислоты; с. 94), описывающая равновесие между комплексом и составляющими его компонентами в свободном состоянии. Константа ассоциации измеряется в М-1; чем больше значение этой константы, тем выше сродство лиганда и белка.

Константа равновесия Кa равна отношению скоростей прямой (образование комплекса) и обратной (диссоциация комплекса) реакций. Реакция образования комплекса описывается константой скорости ra, а реакция диссоциации — константой скорости rd. Как мы обсудим в следующей главе, константы скорости являются константами пропорциональности, определяющими долю вещества, реагирующего за данный промежуток времени.

Если в реакции участвует одна молекула, как при диссоциации РL —> Р L, это реакция первого порядка, а соответствующая константа скорости (rd) имеет размерность обратного времени (с-1). Если реагируют две молекулы, как при образовании комплекса Р L —>

Ключевые договоренности.

Константы равновесия принято обозначать заглавной буквой К, а константы скорости — строчной r.■

Если обе части уравнения 5-2 умножить на концентрацию лиганда, то станет видно, что отношение концентраций связанного и свободного белка прямо пропорционально концентрации свободного лиганда;

Если концентрация лиганда многократно превышает количество центров связывания лиганда на молекулах белка, то связывание лиганда с белком практически не влияет на концентрацию свободного (несвязанного) лиганда, т. е. [L] остается постоянной. Это допущение применимо к большинству лигандов, связывающихся с белками в клетке, и значительно упрощает наши вычисления.

Теперь мы можем ввести параметр θ (тета), отражающий долю занятых центров связывания лиганда на молекулах белка:

Подставив вместо [РL] произведение Кa [Р][L] (см. уравнение 5-3) и сделав некоторые преобразования, получаем:

Таблица 5-1. Константа диссоциации некоторых комплексов с лигандами*

Цветные полосы означают диапазон значений констант диссоциации при некоторых типичных взаимодействиях в биологических системах. Несколько реакций, такие как взаимодействие белка авидина и кофактора ферментов биотина, выходят за рамки нормального диапазона.

Связывание авидина с биотином такое прочное, что реакцию можно считать необратимой. Специфичное к последовательности взаимодействие белка с ДНК характеризует белки, связывающиеся с определенной последовательностью нуклеотидов в ДНК, в отличие от обычного связывания с произвольным участком ДНК.

Данные значения констант диссоциации верны только в тех конкретных условиях, в которых они были определены. Значения Кd могут сильно изменяться (иногда на несколько порядков) при изменении концентрации солей и pH раствора, а также некоторых других параметров.

* Связь авидина с биотином (кофактором ферментов) является одной из наиболее прочных нековалентных связей, известных в биохимии на сегодняшний день.

** Кальмодулин имеет четыре центра связывания кальция. Здесь приведены значения Кd для центров связывания с наибольшим и наименьшим сродством, полученные в одном эксперименте.

Значение Ка можно определить из графика зависимости θ от концентрации свободного лиганда ([L]), как показано на рис. 5-4, а. Графиком любого уравнения вида х = у/(у z)является гипербола, таким образом, θ представляет собой гиперболическую функцию [L].

Рис. 5-4. Графическое представление связывания лиганда. Представлена зависимость доли занятых центров связывания лиганда (θ) от концентрации свободного лиганда. Обе кривые описываются гиперболическим уравнением, а) Кривая связывания гипотетического лиганда L.

Концентрация лиганда, при которой занята половина центров связывания, соответствует 1/Кa или Кd. Кривая имеет горизонтальную асимптоту при θ = 1 и вертикальную асимптоту при [L] = -1/Кa (не показана), б) Кривая связывания кислорода с миоглобином.

Чаще используют более понятный параметр — константу диссоциации Кa = 1 /Кa. Константа Кd измеряется в молях и характеризует реакцию высвобождения лиганда, т. е. диссоциацию комплекса РL.

При [L] = Кd занята половина центров связывания лиганда. По мере снижения [L] все меньшая доля белка связывает лиганд. Для связывания лиганда в 90% доступных центров связывания значение [L] должно в девять раз превышать Кd.

На практике как меру сродства белка к лиганду константу Кd используют гораздо чаще, чем Кa. Заметьте, что чем меньше Кd, тем выше сродство белка к лиганду. Математические выкладки привели нас к простому утверждению: константа Кd равна молярной концентрации лиганда, при которой занята половина доступных центров связывания.

В данной точке наблюдается полунасыщение белка лигандом. Чем выше сродство белка к лиганду, тем меньше концентрация лиганда, необходимая для достижения полунасыщения, т. е. тем меньше Кd. Некоторые значения констант диссоциации представлены в табл. 5-1; на масштабной линейке нанесены типичные для биологических систем значения констант диссоциации.

Пример 5-1. Константы диссоциации комплекса «Рецептор-Лиганд»

Два белка X и Y связывают один и тот же лиганд А; кривые связывания приведены ниже.

Какова константа диссоциации Кd для каждого белка? Какой белок (X или Y) обладает более высоким сродством к лиганду А?

Решение. Константы диссоциации можно найти из графиков. Если θ представляет собой долю центров связывания, занятых лигандом, то концентрация лиганда, при которой занята половина центров связывания (т. е. точка, в которой кривая связывания пересекает прямую θ = 0,5), соответствует константе диссоциации.

Связывание кислорода с миоглобином подчиняется описанным выше закономерностям. Однако поскольку кислород представляет собой газ, мы должны несколько видоизменить наши уравнения для их использования в лабораторной практике. Для начала вместо концентрации лиганда в уравнение 5-8 подставим концентрацию растворенного кислорода:

Как и для любого другого лиганда, константа Кd равна концентрации кислорода, при которой занята половина центров связывания миоглобина.

Обозначим эту концентрацию через [О2]0,5. Уравнение 5-9 примет вид:

В тех случаях, когда в качестве лиганда выступает кислород, изменяемым параметром является парциальное давление кислорода в газовой фазе над раствором (рO2), поскольку его легче контролировать, чем концентрацию растворенного кислорода в жидкой фазе.

Концентрация летучего вещества в растворе всегда пропорциональна его парциальному давлению в газовой фазе. Таким образом, если мы обозначим парциальное давление кислорода при его концентрации [О2]0,5 как Р50 и произведем замены в уравнении 5-10, то получим следующее выражение:

Кривая связывания миоглобина с кислородом в координатах θ от рO2 представлена на рис. 5-4, б.

Структура белка влияет на связывание с лигандом

Связывание лиганда с белком редко осуществляется так просто, как может показаться при рассмотрении уравнения реакции. Это взаимодействие в значительной степени зависит от структуры белка и часто сопровождается конформационными изменениями. Например, специфичность связывания гема с лигандами изменяется, когда он встроен в молекулу миоглобина.

Сродство монооксида углерода СО к свободному гему в 20 000 раз превышает сродство кислорода (т. е. Кd или Р50 для связывания СО со свободным гемом в 20 000 раз ниже, чем соответствующие значения для кислорода), однако сродство СО к гему в составе миоглобина лишь в 200 раз выше сродства кислорода.

Это различие частично объясняется стерическими факторами. При связывании O2 со свободным гемом ось молекулы кислорода расположена под углом к связи Fе—О (рис. 5-5, а). Напротив, при связывании СО со свободным гемом все три атома — Fе, С и О — расположены на одной прямой (рис. 5-5, б).

В обоих случаях образование связи определяется геометрией гибридных орбиталей каждого лиганда. Когда гем связан с миоглобином, остаток His64 (His Е7) на O2-связывающей стороне гема расположен слишком далеко, чтобы координировать гемовое железо, но тем не менее способен взаимодействовать с лигандом гема.

Этот остаток, называемый дистальным гистидином, образует водородную связь с молекулой O2 (рис. 5-5, в), но может препятствовать линейному связыванию СО, что и объясняет относительное снижение сродства СО к гему в составе миоглобина (и гемоглобина).

Рис. 5-5. Стерические эффекты при связывании лигандов с гемом в составе миоглобина. а) При связывании кислорода с гемом ось молекулы O2 расположена под углом к порфириновому кольцу, что вполне допускает конформация миоглобина. б) При связывании монооксида углерода со свободным гемом ось молекулы СО перпендикулярна плоскости порфиринового кольца.

При связывании с гемом в составе миоглобина молекула СО должна несколько изогнуться, поскольку ее вертикальному положению мешает остаток His Е7 (дистальный His). Это ухудшает связывание СО с миоглобином. в) Еще один способ представления гема в составе миоглобина (PDB ID 1МВO), демонстрирующий расположение ключевых аминокислотных остатков.

Связывание кислорода с гемом в миоглобине зависит, кроме того, от колебаний молекулы белка. Гем спрятан глубоко внутри белковой глобулы, так что кислород не может напрямую проникнуть из раствора к центру связывания. Если бы белок имел жестко фиксированную структуру, кислород не мог бы хоть в сколько-нибудь значительной степени связываться или высвобождаться из комплекса с гемом.

Но быстрые изгибы боковых цепей аминокислотных остатков способствуют кратковременному образованию пор в структуре белка, позволяющих кислороду проникать внутрь глобулы и выходить наружу. Компьютерное моделирование быстрых структурных флуктуаций в молекуле миоглобина подтверждает существование нескольких подобных путей.

Один из основных путей открывается при вращении боковой цепи дистального His (His Е7), происходящем во временном интервале нескольких наносекунд (10-9 с). Этот факт еще раз подтверждает, что даже едва заметные конформационные изменения могут иметь решающее значение для активности белка.

Гемоглобин переносит кислород в крови

Кислородсвязывающий белок гемоглобин — транспорт кислорода.Практически весь кислород, транспортируемый кровью в организме животных, связан с гемоглобином и переносится с его помощью в составе эритроцитов (красных кровяных клеток). Нормальные эритроциты человека представляют собой небольшие двояковогнутые диски с диаметром от 6 до 9 мкм.

Они образуются из стволовых клеток- предшественников — гемоцитобластов. В процессе созревания стволовые клетки образуют дочерние клетки, которые синтезируют большое количество гемоглобина и теряют ряд внутриклеточных органелл — ядро, митохондрии и эндоплазматический ретикулум.

Таким образом, эритроциты представляют собой неполноценные, рудиментарные клетки, нс способные к самовоспроизведению, которые в организме человека живут не более 120 дней. Основная функция эритроцитов — это перенос гемоглобина, растворенного в цитозоле в высокой концентрации (массовая доля около 34%).

В артериальной крови, проходящей от легких через сердце к периферическим тканям, гемоглобин примерно на 96% насыщен кислородом. В венозной крови, возвращающейся к сердцу, гемоглобин насыщен кислородом лишь на 64%. Таким образом, каждые 100 мл крови оставляют в тканях около одной трети содержащегося в крови кислорода, т. е. 6,5 мл газообразного O2 (при атмосферном давлении и температуре тела).

Миоглобин, у которого кривая связывания кислорода имеет вид гиперболы (рис. 5-4, б), сравнительно малочувствителен к небольшим изменениям концентрации растворенного кислорода и потому может использоваться в качестве хранилища (депо) кислорода. Гемоглобин, состоящий из нескольких субъединиц и имеющий несколько центров связывания O2, лучше приспособлен для транспортировки кислорода.

Как мы увидим далее, взаимодействие между субъединицами мультимерного белка способствует его высокой чувствительности к небольшим изменениям концентрации лиганда. Взаимодействие между субъединицами гемоглобина вызывает конформационные изменения, которые в свою очередь изменяют сродство белка к кислороду.

Субъединицы гемоглобина имеют структуру, сходную со структурой миоглобина

Гемоглобин (Нb) имеет молекулярную массу 64 500 и представляет собой практически сферическую молекулу с диаметром около 5,5 нм. Этот тетрамерный белок содержит четыре простетические гемовые группы, каждая из которых соединена с одной полипептидной цепью.

β-субъединиц совпадают менее чем на 50%, трехмерные структуры этих двух типов субъединиц очень похожи. Более того, их конформация очень напоминает структуру миоглобина (рис. 5-6), несмотря на то что три полипептидные последовательности имеют идентичные аминокислотные остатки лить в 27 позициях (рис. 5-7).

Все три полипептида относятся к семейству глобинов. Правила обозначения спиральных участков, описанные выше для миоглобина, применимы и к полипептидам гемоглобина, за исключением того, что его α-субъединица не имеет короткой спирали D. Гемсвязывающий карман сформирован в каждой субъединице главным образом спиралями Е и F.

Рис. 5-6. Сравнение структуры миоглобина (PDB ID 1МВO) и β-субъединицы гемоглобина (PDB ID 1HGA).

Рис. 5-7. Сравнение аминокислотных последовательностей миоглобина кита и α- и β-субъединиц гемоглобина человека. Пунктирными линиями помечены границы спиральных участков. Для оптимального выравнивания в обе последовательности Нb необходимо ввести короткие пробелы.

За исключением отсутствующей спирали D в Нbа, все остальные спиральные участки можно именовать в соответствии с существующими договоренностями, что подчеркивает одинаковое расположение идентичных аминокислотных остатков во всех трех структурах (выделены цветом).

Розовым цветом выделены аминокислотные остатки, которые идентичны во всех известных глобинах. Заметьте, что аминокислотные остатки с одинаковыми буквенно-численными обозначениями не обязательно находятся в одинаковых позициях в линейных полипептидных последовательностях.

Например, дистальный остаток His во всех трех последовательностях называется His Е7, но в последовательностях Mb, Нb α и Нb β он представляет собой соответственно His64, His58 и His63. Не входящие в состав спиралей аминокислотные остатки, расположенные за пределами первого (А) и последнего (Н) α-спирального участка на N- и С-концах последовательности, соответственно обозначаются как NA и НС.

Четвертичная структура гемоглобина характеризуется сильным взаимодействием между субъединицами разных типов. В зоне контакта α1β1 (и аналогичным образом в зоне контакта α2β2) расположено более 30 аминокислотных остатков, и это обеспечивает настолько высокую прочность взаимодействия, что, хотя при обработке гемоглобина мочевиной в сравнительно мягких условиях тетрамер распадается на два ap-димера, далее эти димеры нс распадаются.

В зоне контакта α1β2 (и α2β1) задействовано по 19достатков (рис. 5-8). В местах контактов преобладают гидрофобные взаимодействия, однако образуются также водородные связи и ионные пары (иногда называемые солевыми мостиками), значение которых мы обсудим далее.

Рис. 5-8. Основные взаимодействия между субъединицами гемоглобина. α-Субъединицы изображены более светлыми, β-субъединицы — более темными. Наиболее сильное взаимодействие (выделено) наблюдается между субъединицами разных типов. Связывание кислорода слабо влияет на контакт α1β1, однако в контакте α2β2 наблюдаются значительные изменения с разрывом нескольких ионных пар (РDВ ID 1HGА).

Связывание кислорода сопровождается структурными перестройками гемоглобина

Методом рентгеноструктурного анализа было показано наличие двух основных конформаций гемоглобина, называемых R- и Т-состояниями. Кислород связывается с гемоглобином, находящимся в любом состоянии, но гораздо большее сродство он все же имеет к гемоглобину в состоянии R. Связывание с кислородом стабилизирует R-состояние.

Экспериментально показано, что в отсутствие кислорода более устойчивым является состояние Т и преобладает конформация дезоксигемоглобина. Буквы Т и R исходно обозначали соответственно напряженную (англ, tense) и релаксированную (англ. relaxed) конформацию, поскольку состояние Т стабилизировано большим количеством ионных пар, многие из которых расположены в зоне контакта α1β2 (и α2β1) (рис. 5-9).

Связывание кислорода с субъединицей гемоглобина, находящейся в состоянии Т, приводит к конформационным изменениям и переходу в состояние R. В результате изменения конформации всего белка структура отдельных субъединиц изменяется слабо, однако пары αβ- субъединиц скользят одна по другой и поворачиваются, так что расстояние между β-субъединицами уменьшается (рис. 5-10). При этом разрушаются некоторые ионные пары, стабилизирующие состояние Т, и образуются новые.

Рис. 5-9. Некоторые ионные пары, стабилизирующие состояние Т дезоксигемоглобина. а) Крупный план фрагмента молекулы дезоксигемоглобина, находящейся в состоянии T (PDB ID 1HGA). Пунктирными линиями изображены ионные пары, образованные между His НСЗ и Asp FG1 из β-субъединицы (показана синим цветом), а также между Lys С5 из a-субъединицы (показана серым цветом) и α-карбоксильной группой His НСЗ из β-субъединицы.

Рис. 5-10. Переход из состояния Т в состояние R (PDB ID 1HGA и 1ВВВ). β-Субъединкцы изображены синим цветом, α-субъединицы — серым, как и на рис. 5-9. Положительно заряженные боковые цепи и концевые остатки, участвующие в образовании ионных пар, выделены синим цветом, а их отрицательно заряженные партнеры выделены красным цветом.

Изображены, но не подписаны остатки Lys С5 в каждой α-субъединице и остатки Asp FG1 в каждой β-субъединице (ср. рис. 5-9, а). Заметьте, что молекулы повернуты несколько иначе, чем на рис. 5-9. Переход из состояния Т в состояние R сильно смещает пары субъединиц, вызывая изменения в некоторых ионных парах.

Особенно важно, что остаток His НСЗ на С-конце β-субъединицы, участвующий в образовании солевого мостика в состоянии Т, в состоянии R поворачивается к центру молекулы и не образует ионной пары. Еще одним важным результатом перехода T —> R является сужение кармана между β-субъединицами.

Макс Перутц предположил, что сигналом к осуществлению перехода Т -—> R является изменение положения боковых цепей ключевых аминокислотных остатков, окружающих гем. В состоянии Т порфириновое кольцо несколько сжато, так что гемовое железо чуть выдвинуто в сторону проксимального гистидина (His F8).

Рис. 5-11. Конформационные изменения в области гема при связывании кислорода с дезоксигемоглобином (РDВ ID 1HGА и 1ВВВ). Сдвиг спирали F при связывании гема с молекулой O2 считают одним из тех изменений в структуре молекулы, которые провоцируют переход Т —> R.

Связывание кислорода с гемоглобином — кооперативный процесс

Гемоглобин должен эффективно связывать кислород в легких, где рO2 составляет приблизительно 13,3 кПа, и высвобождать его в тканях, где рO2 примерно равно 4 кПа. Миоглобин или любой другой белок, характеризующийся гиперболической кривой связывания с кислородом, не подходит для выполнения этой задачи по причинам, показанным на рис. 5-12.

Белок, обладающий высоким сродством к кислороду, будет эффективно связывать его в легких, но не будет высвобождать в тканях в достаточном количестве. Если белок имеет сравнительно низкое сродство к кислороду, позволяющее высвобождать его в тканях, он нс сможет связывать достаточное количество кислорода в легких.

В случае гемоглобина эта проблема решается путем перехода из низкоаффинного состояния (состояния Т) в высокоаффинное (состояние R) по мере связывания молекул O2. В результате кривая связывания гемоглобина с кислородом имеет S-образный (сигмовидный) характер (рис. 5-12).

Белок, состоящий из одной субъединицы с одним центром связывания лиганда, не может иметь S-образную кривую связывания, даже при условии, что это связывание сопровождается конформационными изменениями, поскольку каждая молекула лиганда связывается независимо и нс может влиять на взаимодействие с другими молекулами.

Напротив, присоединение O к одной субъединице гемоглобина изменяет сродство к кислороду других субъединиц. Первая молекула O2, взаимодействующая с дезоксигемоглобином, связывается слабо, поскольку субъединица находится в состоянии Т. Но это взаимодействие приводит к конформационным изменениям, затрагивающим соседние субъединицы, в результате чего облегчается присоединение следующих молекул O2.

Действительно, переход Т —> R во второй субъединице осуществляется быстрее, если в первой субъединице произошло связывание O2. Последняя (четвертая) молекула кислорода связывается с гемом в субъединице, уже находящейся в состоянии R, и поэтому сродство гемоглобина к четвертой молекуле кислорода гораздо выше, чем к первой.

Рис. 5-12. Сигмовидная кривая, отражающая кооперативность связывания. Сигмовидную (S-образную) кривую можно рассматривать как гибридную кривую, отражающую переход от низкоаффинного к высокоаффинному состоянию. Сигмовидная кривая свидетельствует о том, что кооперативное связывание делает гемоглобин более чувствительным к небольшим изменениям концентрации O2 между тканями и легкими.

Белок, в котором связывание лиганда в одном центре молекулы влияет на связывание в другом центре, называется аллостерическим белком. Термин «аллостерический» происходит от греческих слов alios («другой») и stereos («твердый» или «форма»).

Таким образом, аллостерическими называют белки, принимающие «другую форму» или конформацию при связывании лигандов (модуляторов). Конформационные изменения, индуцированные модулятором (или модуляторами), представляют собой переходы между менее активной и более активной формами белка.

Модуляторы аллостерических белков могут быть ингибиторами или активаторами. Если роль лиганда и модулятора выполняет одно и то же вещество, такое взаимодействие называют гомотропным, в противном случае взаимодействие называют гетеротропным.

Кооперативное связывание лиганда с мультимерным белком, подобное тому, какое мы наблюдали в случае взаимодействия гемоглобина

с кислородом, является формой аллостерического взаимодействия, которое часто происходит в мультимерных белках. Связывание одного лиганда изменяет сродство остальных центров связывания, так что кислород в данном случае выступает и в качестве лиганда, и в качестве активирующего гомотропного модулятора.

формационными изменениями, передаваемыми от одной субъединицы к другой в результате их взаимодействий. Сигмовидная кривая связывания свидетельствует о кооперативности взаимодействия. Такой тип связывания гораздо более чувствителен к концентрации лиганда и используется во многих мультисубъединичных белках. Принципы аллостерического взаимодействия применимы также и к регуляторным ферментам, как мы увидим далее в гл. 6.

Кооперативные конформационные изменения зависят от различий в структурной стабильности отдельных частей белка, обсуждавшихся в гл. 4. Центр связывания аллостерического белка обычно построен из устойчивых фрагментов, поблизости от которых расположены сравнительно лабильные участки, способные часто менять свою конформацию или находящиеся в беспорядочном перемещении (рис. 5-13).

При связывании лиганда подвижные части центра связывания стабилизируются в определенной конформации, что вызывает изменение конформации прилежащих участков полипептидной цепи. Если бы весь центр связывания имел жестко зафиксированную структуру, то при связывании лиганда лишь небольшие структурные изменения могли бы возникать в нем самом и распространяться на другие участки белка.

Рис. 5-13. Структурные перестройки в мультисубъединичном белке в процессе кооперативного связывания лиганда. Структурная стабильность белковой молекулы в разных участках может быть различной. На данной схеме представлен гипотетический димерный белок, имеющий участки высокой (синий цвет), промежуточной (зеленый цвет) и низкой стабильности (розовый цвет).

Центр связывания лиганда построен из участков как с высокой, так и с низкой стабильностью, так что сродство белка к лиганду сравнительно небольшое. Конформационные изменения, происходящие при связывании лиганда, переводят белок из низкоаффинного в высокоаффинное состояние — вариант индуцированного соответствия.

Подобно миоглобину, гемоглобин может связывать не только кислород, но и другие лиганды. Важным примером является связывание монооксида углерода (угарного газа), который связывается с гемоглобином примерно в 250 раз лучше, чем кислород. Вдыхание СО может вызвать очень тяжелые последствия для здоровья человека (доп. 5-1).

Кооперативное связывание лиганда можно описать количественно

Кооперативное связывание кислорода с гемоглобином впервые было проанализировано Арчибальдом Хиллом в 1910 г. Именно на этой работе основан общий подход к изучению кооперативного взаимодействия лигандов с мультисубъединичными белками.

Для белка, имеющего n центров связывания, уравнение 5-1 можно привести к виду

Р nL ⇄ РLn (5-12)

а выражение для константы ассоциации можно записать следующим образом:

Аналогично уравнению 5-8 запишем выражение для θ

Произведем перестановку и возьмем логарифм обеих частей уравнения:

где Кd = [L]n 0,5.

Выражение 5-16 называют уравнением Хилла, а график в координатах lg [θ/(1 — θ)] от lg[L] называют графиком Хилла. В соответствии с уравнением угол наклона графика Хилла должен быть равен п. Но угол наклона, определенный на основании экспериментальных данных, на самом деле отражает не число центров связывания, а степень взаимодействия между ними.

Поэтому угол наклона графика Хилла, названный коэффициентом Хилла (nH), является мерой кооперативности. Если коэффициент Хилла равен единице, связывание лиганда не кооперативное, что возможно даже в мультисубъединичном белке, если его субъединицы не взаимодействуют друг с другом.

Значение nH>1 указывает на наличие положительной кооперативности при связывании лиганда. Именно такая ситуация наблюдается в случае гемоглобина, когда связывание одной молекулы лиганда способствует связыванию других молекул. Теоретический верхний предел значения nH равен n.

В подобном случае взаимодействие полностью кооперативное: все центры связывания на молекуле белка должны связывать лиганд одновременно, и не должно существовать частично насыщенных лигандом молекул белка. На практике этот предел никогда не достигается; измеряемое значение nH всегда меньше реального числа центров связывания лиганда в белке.

Значение nH <1 говорит об отрицательной кооперативности, т. е. о явлении, при котором связывание одной молекулы лиганда препятствует связыванию остальных. Детально описанных случаев отрицательной кооперативности известно мало.

Для того чтобы применить уравнение Хилла к связыванию кислорода с гемоглобином, нам следует заменить [L] на рO2 и Кd на Pn50:

Дополнение 5-1. МЕДИЦИНА. Угарный газ: невидимый убийца

Озеро Пауэлл, Аризона, США, август 2000 г. Семья проводила каникулы на арендованной плавучей барже. Они включили электрический генератор, поскольку пользовались кондиционером и смотрели телевизор. Примерно через четверть часа два брата в возрасте 8 и 11 лет спрыгнули в воду с кормовой палубы.

Прямо под ней находилась вытяжка генератора. Всего за две минуты оба мальчика надышались угарным газом, накопившимся в пространстве под палубой, и утонули. Этот случай, а также многие другие, произошедшие в 1990-е гг. на плавучих баржах подобной конструкции, привели к тому, что эти суда были отозваны для реконструкции вытяжки генераторов.

Монооксид углерода (СО, угарный газ) — газ без цвета и запаха; во всем мире ежегодно более половины умерших от отравления погибли от действия угарного газа. Сродство СО к гемоглобину примерно в 250 раз превышает сродство кислорода. В результате сравнительно невысокий уровень СО в воздухе может привести к трагическим последствиям. Комплекс, образующийся при связывании СО с гемоглобином, называют карбоксигемоглобином (СОНb).

Некоторое количество СО образуется в результате естественных процессов, однако локальное высокое содержание этого газа в воздухе, как правило, является результатом деятельности человека. Очень большой вклад в повышение уровня СО вносят выхлопные газы и газообразные отходы производств, поскольку СО — побочный продукт неполного сгорания ископаемого топлива.

Только в США ежегодно около 4000 человек становятся жертвой отравления СО (как случайно, так и преднамеренно). Многие несчастные случаи связаны с накоплением СО в замкнутых пространствах, например, в домах при неаккуратном протапливании печи. Однако отравиться СО можно и на открытом воздухе, вдыхая выхлопы генераторов, лодочных моторов, тракторов, различных транспортных средств или газонокосилок.

Концентрация СО в атмосфере редко достигает опасного уровня: обычно она колеблется от 0,05 ppm (частей на миллион) в отдаленных и малонаселенных районах до 3-4 ppmв некоторых городах северного полушария. По нормам, принятым в США, количество поглощенного человеком за восьмичасовой рабочий день СО не должно превышать 50 ppm.

Диэтилгидроксиламин (DEHA)

Летучий, обладающий свойствами пассиватора, поглотитель кислорода, который взаимодествует с кислородом по следующей реакции:

 4 (CH3CH2)2 NOH 9O2 → 8 CH3 COOH 2 N2 14 H20 

 Теоретически, 1,24 части DEHA требуется для связывания 1 части кислорода, но на практике используют 3 части  DEHA для поглощения 1 части кислорода. 

Диэтилгидрокисламин имеет ряд преимуществ перед другими поглотителями кислорода. Он обладает более высоким значением летучести и металл-пассивирующими свойствами, чем сульфит, гидразин и эритробат. DEHA безопаснее, чем гидразин. Его требуется меньшие количества, чем эритробата и метилэтилкетоксима для связывания кислорода. По сравнению с другими реагентами для связывания кислорода, скорость реакции DEHA с кислородом значительно выше.

Катализированный сульфит натрия является одним из самых эффективных поглотителей кислорода при применении его в системах с низкими значениями давления. В то время как для систем с высоким давлением, лучшим является диэтилгидроксиламин.

Уже при 21ºС и при pH 8,5 DEHA снижает концентрацию растворенного кислорода с 9 до 4 мг/л за 10 минут, в том время как, карбогидразид, катализированный гидрохиноном, и эриторбат снизят содержание кислорода всего до 7 мг/л.

За 30 минут DEHA снизит концентрацию растворенного кислорода до 1 мг/л, в то время как другие поглотители –  только до 6 мг/л.

Диэтилгидроксиламин способствует формированию прочной магнетитовой пленки, предохраняющей от коррозии стальные поверхности элементов оборудования и защищающий таким образом весь паро-конденсатный контур.

DEHA находит широкое применение при замене гидразингидратной обработки воды в котлах высокого давления.

Сравнительная таблица эффективности поглотителей кислорода

Сравнение токсичности реагентов для поглощения кислорода

Таким образом, самым токсичным является гидразин, а самым безопасным — МЕКО, на втором месте находится диэтилгидроксиламин, превосходящий по безопасности карбогидразид и эриторбат.

Скорость связывания кислорода различными реагентами

Наиболее быстро связывает кислород сульфит натрия, однако при его использовании увеличивается солесодержание воды, что может провоцировать коррозию. Поэтому предпочитительно использовать органические поглотители кислорода.